Strukturen von KLK-Protease-Substrat-Übergangszuständen

Kallikrein-Peptidasen (KLKs) sind 15 chymotrypsin-ähnliche Serinproteasen, die unterschiedlich stark in nahezu allen Gewebe des Menschen sekretiert werden. Einige KLKs sind für die Befruchtung, Zahnentwicklung, und Schuppung der Haut erforderlich. Zudem sind sie an Erkrankungen wie Prostatakrebs oder Neurodermitis beteiligt. Darüberhinaus ist KLK3 (PSA) ein weitverbreiter klinischer Marker für Prostatakrebs. Bisher ist über Substraterkennung und Katalysemechanismen der KLKs auf struktureller Ebene wenig bekannt. Daher sind Studien der Enzym-Substrat-Übergangszustände (ÜZ) wünschenswert, insbesondere deren Analyse mittels kristallographischer Methoden. Für die KLKs 1 bis 8 und KLK10 sind Kristallisationsbedingungen bekannt. Als erste Stufe des Projekts werden KLKs nach etablierten Protokollen aus E. coli, L. tarentolae und HEK293-Zellen gereinigt. Glykosylierte KLKs können mit deglykosylierenden Enzymen behandelt werden, um die Kristallisation zu erleichtern. Erhaltene Kristalle werden mit Substratanaloga versetzt, um Komplexe mit dem jeweiligen KLK bilden. Diese Komplexe stellen nicht-kovalente Enzym-Substrat-("Michaelis")-Komplexe, tetraedrische ÜZ, Acyl-zwischenprodukte, oder Enzym-Produktkomplexe dar. Zur Stabilisierung der kurzlebigen ÜZ können inaktive Mutanten eingesetzt werden, z. B. KLK2-Ser195Ala mit Oktapeptiden, bzw. nicht spaltbare Analoga der Peptidbindung, z.B. reduzierte Amide (-CH2-NH-). Tetraedrische ÜZ können durch Difluoromethylenketone (-CO-CF2-) und Phosphinate (-PO(OPhe)- ) nachgeahmt werden. Schließlich können Aldehyd- und Borsäure-Peptid-inhibitoren Acylzwischenprodukte imitieren, während sich Enzym-Produktkomplexe eventuell in Kristallen einfrieren lassen. Labile Komplexe können durch Disulfidverbrückung von KLK-Cys-Mutanten und Cys-haltigen Verbindungen stabilisiert werden. Die geeignetsten Disulfid-positionen wurden durch Modellieren unter Verwendung bekannter Kristallstrukturen bestimmt. Basierend auf der ersten Projektphase wird in der zweiten Phase die Komplexbildung von aktiven KLKs mit KLK- Proformen und anderen natürlichen Substraten unternommen, darunter kommerzielle Produkte oder rekombinante Proteine: Semenogeline, Matrixproteine der Zähne und corneodesmosomale Proteine. Als Spezialfall "langsamer" Substrate sollen Kazal-Inhibitoren (LEKTIs) im Komplex mit KLKs kristallisiert werden. Ausgewählte Substratfragmente können chemisch an geeignete Verbindungen ligiert werden, um stabile KLK-ÜZ-Komplexe zu erhalten, eventuell unterstützt durch Disulfidverbrückung. Idealerweise sollte eine Serie aller ÜZ-Analoga mit einem Vollängesubstrat erzeugt werden. Die Analyse dieser Komplexe wird das Verständnis von Substraterkennung und -Spaltung durch KLKs und Serinproteasen im Allgemeinen stark eweitern. Es ist zu erwarten, dass die vorgeschlagenen Methoden und Strategien neue Wege für die Grundlagenforschung, sowie bioorthogonale und sogar pharmazeutische Anwendungen eröffnen werden.

Das Projekt untersuchte die Struktur und Funktion von Serinproteasen aus der Familie der humanen Kallikrein-Proteasen (KLKs). Einige KLK-Familienmitglieder sind bedeutend für Krankheiten wie Prostata- oder Eierstockkrebs. Insbesondere sollten die Schritte des katalytischen Zyklus der Peptid- oder Proteinhydrolyse analysiert werden. Zu diesem Zweck wurden vor allem KLKs mit bekannten Kristallisationsbedingungen strukturell bestimmt und Experimente über ihre Funktion durchgeführt. Strukturen des vermuteten Tumorsuppressors KLK10 in einer aktiven und gehemmten, aber zymogen-artigen Konformation, wurden gelöst und gaben überraschende Einblicke in die ungewöhnliche Aktivierung und einen neuartigen Zn2+-Inhibitionsmechanismus. Besonders einige unstrukturierte Oberflächen-Loops und der N-Terminus sprechen für einen teilweise Induced-Fit-Mechanismus beim Substratumsatzes. Außerdem wurden zwei Strukturen von KLK8 bestimmt, das an neuronalen Synapsen bei der Gedächtnisbildung mitwirkt. Die umfassende Studie enthält eine gründliche Spezifitäts-profilanalyse, Mutationsanalysen, die stimulierende Ca2+ und inhibitorische Zn2+-Bindungs-stellen lokalisierten. Molekulardynamische Berechnungen erklärten die Substratbindung im Vergleich zum Liganden-freien und Inhibitor-gebundenen Zustand. Darüber hinaus zeigten die Berechnungen, dass KLK8 ein allosterisches Oberflächen-Loop-Netzwerk besitzt, von dem ähnliche Komponenten in anderen menschlichen KLKs vorliegen. Hier scheint der Grundmechanismus eher der konformationellen Selektion anzugehören, der bisher von unserer Gruppe für Glykan-freies und glykosyliertes KLK2 in einem anderen Projekt bestätigt wurde. Zudem wurde eine klinische und molekularbiologische Studie in Kooperation durchgeführt, welche die Rolle von KLK6 und KLK8 als wertvolle Biomarker für Eierstockkrebs bestätigte. Die Bedeutung von Glykanen als Regulatoren von Enzymen inspirierte einen Übersichtsartikel zur Glykosylierung von Proteasen und deren Einfluss auf die jeweiligen katalytischen Übergangszustände enzymatischer Aktivität, mit verschiedenen Beispiele von KLKs. Eine weitere Kooperation verwendete reine Computermethoden, um die wahrscheinlichste Substratspezifität von KLK7 zu berechnen. Zusätzlich wurde ein unerwarteter Wechsel des tetraederischen Übergangszustandes in der Molekulardynamik beobachtet, was zu einem umgekehrten Peptidrückgrat des Substrats im aktive Zentrum führte. Dieser Befund kann als Grundlage für die Synthese neuer pharmazeutischer Inhibitoren dienen. Schließlich gelang es in einer Kooperation die NMR-Struktur des humanen Polypeptidinhibitors SPINK6 zu lösen, der unter anderem mit zwei alternativen Konformationen KLK4 ähnlich einem Substrat-Übergangszustand binden kann. Insgesamt verlagerte sich das Projekt stärker auf die Konformationen der KLKs, die durch neue Erkenntnisse zur konformationellen Selektion angeregt wurden. Jedoch kann dieser Mechanismus wie bei anderen Enzymen mechanistisch zum Induced Fit-Modell übergehen.