Subzelluläre Verteilung von ALDH2 und Nitrat-Metabolismus

Die klinische Wirkung von Nitroglycerin (Glyceroltrinitrat, GTN) und anderen organischen Nitraten beruht auf der Erweiterung von großen Blutgefäßen (Koronararterien, venösen Kapazitätsgefäßen), was zu einer Verbesserung der Durchblutung des Herzens und einer Verminderung der kardialen Vorlast führt. GTN ist eine Prodrug, die in Gefäßmuskelzellen enzymatisch bioaktiviert wird, wobei Stickstoffmonoxid (NO) entsteht, das durch Aktivierung löslicher Guanylatcyclase cGMP-vermittelte Vasodilatation auslöst. Das Schlüsselenzym der GTN-Bioaktivierung ist Aldehyd-Dehydrogenase-2 (ALDH2). Kontinuierliche Behandlung von Blutgefäßen mit GTN führt zur oxidativen Inaktivierung von ALDH2, was möglicherweise die Entwicklung vaskulärer Nitrattoleranz erklärt, d.h. den Verlust der therapeutischen Wirkung von GTN nach längerfristiger Applikation. In der Leber katalysiert ALDH2 die Entgiftung von aus Ethanol gebildetem Acetaldehyd und anderen reaktiven Aldehyden. Das Protein wird als Vorläufer mit einer N-terminalen Signalsequenz exprimiert, die dessen Import in die mitochondriale Matrix von Hepatocyten vermittelt. Aufgrund der nahezu ausschließlich mitochondrialen Lokalisierung von ALDH2 in der Leber, geht man allgemein davon aus, dass die vaskuläre Bioaktivierung von GTN in den Mitochondrien der glatten Gefäßmuskelzellen stattfindet. Wir haben allerdings kürzlich gezeigt, dass ALDH2 in Blutgefäßen von Nagetieren und Menschen hauptsächlich cytosolisch vorliegt. Da die GTN-induzierte Relaxation von ALDH2-defizienten Mäuseaorten durch cytosolische aber nicht mitochondriale Überexpression von ALDH2 wieder hergestellt wurde, scheint die subzelluläre Verteilung des Enzyms wesentlichen Einfluss auf die Bioaktivität von GTN zu haben. Im vorgeschlagenen Projekt werden wir die subzelluläre Lokalisation der ALDH2 in verschiedenen Zellen und Geweben untersuchen und ALDH2 Gentranskripte sequenzieren, um den Mechanismus der differentiellen Expression des Proteins mit und ohne mitochondriale Signalsequenz aufzuklären. Insbesonders werden wir den Effekt der ALDH2-Lokalisierung auf vaskuläre GTN-Bioaktivierung und Nitrattoleranz untersuchen. Laut unserer Arbeitshypothese katalysiert cytosolische ALDH2 die Bildung von NO, wohingegen mitochondrialer GTN- Metabolismus oxidativen Stress bewirkt und damit der Relaxation entgegenwirkt und zur Entwicklung von Toleranz beiträgt. Diese Hypothese soll mittels diverser in vitro und in vivo Modelle und durch Überexpression cytosolischer und mitochondrialer ALDH2 in ALDH2 knockout-Mäusen getestet werden. Die geplanten Untersuchungen werden nicht nur zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen der Bioaktivierung von GTN und der Entwicklung vaskulärer Nitrat-Toleranz beitragen, sondern auch das derzeitige Wissen über die differentielle Expression von ALDH2 in Säugetiergeweben vertiefen.

Im voliegenden Projekt untersuchten wir die zellulären Mechanismen der therapeutischen Wirkung von Nitroglycerin (Glyceroltrinitrat, GTN), einem Arzneimittel das seit mehr als 130 Jahren zur Therapie der Koronaren Herzkrankheit und anderen kardiovaskulären Erkrankungen eingesetzt wird. Die klinische Wirkung von GTN und anderen organischen Nitraten beruht auf der Erweiterung von Blutgefäßen, vor allem Koronararterien und venösen Kapazitätsgefäßen, was zu verbesserter Durchblutung des Herzens und Verminderung der kardialen Vorlast führt. Die biologische WIrkung von GTN erfordert Bioaktivierung des organischen Nitrats durch Aldehyd-Dehydrogenase-2 (ALDH2). Diese enzymatische Reaktion führt zur Bildung von Stickstoffmonoxid (NO), das über Aktivierung löslicher Guanylatcyclase (sGC) cGMP-vermittelte Vasodilatation bewirkt. Das Schlüsselenzym der Bioaktivierung von GTN ist Aldehyd-Dehydrogenase-2 (ALDH2). Während ALDH2 in Hepatocytennahezu ausschließlichinMitochondrienvorkommt, exprimieren Gefäßmuskelzellen das Enzym vorwiegend im Cytosol. Wir untersuchten die Ursachen und Konsequenzen der unterschiedlichen subzellulären Lokalisation der ALDH2 and den Mechanismus der durch ALDH2 katalysierten Bildung von NO. Dazu benutzten wir einen neu entwickelten Protein-basierten Sensor, der uns ermöglichte die NO-Bildung in Gefäßmuskel- zellen in Echtzeit als veränderte Floureszenz-Emission zu beobachten und zu quantifizieren. Die erhaltenen Daten haben wir mit der, als sGC-Aktivierung gemessenen, Bioaktivierung von GTN verglichen. Die Bildung von NO aus pharmakologisch relevanten Konzentrationen von GTN war strikt von ALDH2 abhängig und korrelierte exzellent mit sGC-Aktivierung und Akkumulation von cGMP in intakten Zellen. Diese Ergebnisse zeigten, dass die durch ALDH2 katalysierte Reaktion für die GTN-Bioaktivierung notwendig und hinreichend ist. Verlust der therapeutischen Wirksamkeit von GTN nach einigen Stunden kontinuierlicher Applikation beeinträchtigt dessen klinische Anwendung. Die Entwicklung dieser GTN- Toleranz wird gemeinhin der Inaktivierung von ALDH2 zugeschrieben, der genaue Mechanismus is aber noch unklar. Wir benutzten wir den neuen NO-Sensor um diese Frage zu klären und quantifizierten die BO-Bildung in GTN-exponierten Einzelzellen. ALDH2 wurde nach einem Turnover zwar nahezu vollständig inaktiviert, katalysierte aber, vermutlich durch langsame partielle reduktive Reaktivierung weiterhin die Bildung geringer Mengen an NO, die mit der Kinetik der Relaxation von Blutgefäßen korrelierte und den vergleichsweise langfristigen therapeutischen Effekt von GTN erklären könnte. Das Resultat dieser Untersuchungen weist darauf hin, dass Nitrattoleranz auf einer noch nicht ausreichend charakterisierten Reaktion von ALDH2 mit GTN beruht, die langsame, irreversible Inaktiverung des Enzyms zur Folge hat. Die vorliegenden Ergebnisse liefern neue Erkenntnisse über die zellulären und molekularen Mechanismen der Bioaktivierung von Nitroglycerin in Blutgefäßen und könnten zur Entwicklung neuer Koronartherapeutika führen, die keine Nitrattoleranz erzeugen.