Transferaseaktivität von Beta-Galaktosidasen mit unterschiedlichen Zuckerakzeptoren

Das Enzym ß-Galaktosidase (EC 3.2.1.23) katalysiert sowie die Hydrolyse wie auch die Transglykosylierung von Laktose und strukturell verwandten Galaktosiden. Diese Transglykosylierungsreaktion beruht auf dem Reaktionsmechanismus der ß-Galaktosidasen und stellt eine attraktive biotechnologische Anwendung dieser Enzyme dar. So werden etwa Galakto-Oligosaccharide erhalten, wenn Laktose als Ausgangssubstrate für die Transgalaktosylierung verwendet wird. ß-Galactosidasen können den Galaktosylrest aber auch auf andere Zucker übertragen (Mannose, Fruktose, N-Acetylneuraminsäure wurden zum Bespiel für diese Reaktion bereits untersucht) und damit zur Synthese von Hetero-Oligosacchariden (HOS) verwendet werden. Durch Wahl von geeignetem Akzeptorzuckers und Enzym können neue HOS erhalten werden, die etwa für die Lebensmittelindustrie von Interesse sind. Das beantragte Projekt beschäftigt sich mit den ß-Galaktosidasen aus probiotischen Bifidobakterien und Milchsäurebakterien (Bifidobacterium longum biovar infantis ATCC 15697, B. breve ATCC 15700, Lactobacillus reuteri (from our culture collection), Lactobacillus bulgaricus ATCC 11842 und Streptococcus thermophilus DSM 20259). Im Speziellen soll deren Fähigkeit und Eignung zum Transfer des Galaktosylrestes auf ausgewählte Zucker untersucht werden. Dadurch sollen neue HOS zugänglich werden, die strukturell verwandt zu Muttermilch- Oligosacchariden sind. Muttermilch-Oligosaccharide zeigen eine Reihe von wichtigen biologischen Eigenschaften, etwa einen ausgeprägten präbiotischen Effekt (gezieltes Fördern des Wachstums erwünschter Darmkeime), Schutz für Infektionen oder als Rezeptor-Analoges, um das Anhaften von pathogenen Keimen im Darm zu verhindern. Wissenschaftlich zielt das beantragte Projekt auf ein besseres und vertieftes Verständnis des Galaktosyltransfers der ausgewählter ß-Galaktosidasen auf unterschiedliche Zuckerakzeptoren, im Detail auf das Substrat Laktose und die beiden primären Reaktionsprodukte Galaktose und Glukose sowie auf die Zucker N-Acetylglukosamin, N- Acetylgalaktosamin und Fukose. Durch Analyse und Quantifizierung dieses Transfers sind Vorhersagen über die Bildung von möglichen Oligosacchariden durch Transgalactosylierung möglich. Im Detail umfasst das Projekt folgende Aufgaben: (i) Klonierung und Expression der gewählten ß-Galaktosidasen, (ii) Charakterisierung dieser rekombinanten ß-Galaktosidasen hinsichtlich ihrer Eigenschaften, die für die Transgalaktosylierung wichtig sind, (iii) detaillierte Studien über die Transgalaktosylierungseigenschaften unter definierten Bedingungen und Bestimmung von individuellen Geschwingkeitskoeffizienten des Transfers, (iv) Analyse der Reaktionsprodukte (Oligosaccharide) mittels Kapillarelektrophorese, Hochdruckchromatographie (HPLC) und NMR.

Bestimmte Oligosaccharide können die Gesundheit von Menschen und Tieren positiv beeinflussen, etwa indem sie das Wachstum oder die Aktivität einer kleinen Gruppe von Mikroorganismen im Darm spezifisch stimulieren. Diese Oligosaccharide werden alsPräbiotika bezeichnet und sind als funktionelle Bestandteile in oder als Zusätze zu Lebensmitteln sehr interessant. Galakto-Oligosaccharide (GOS) sind ein Beispiel für diese Zucker, welche die Kriterien von Präbiotika erfüllen (Unverdaulichkeit durch den Host, Stabilität bei der Passage durch Magen und Dünndarm, spezifisches Stimulieren von Wachstum / Aktivität erwünschter Darmbakterien). GOS sind besonders für die menschliche Ernährung interessant, da sie strukturell bestimmten Muttermilch-Oligosacchariden ähnlich sind. Oligosaccharide in Muttermilch sind eine komplexe Mischung unterschiedlicher Zucker, die neben Galaktose auch aus anderen Zuckern bestehen können (etwa Fukose, N- Acetylglucosamin oder N-Acetylneuraminsäure), sie sind also Hetero-Oligosaccharide (HOS). GOS werden durch Galaktosylierungsreaktionen, die durch ?-Galaktosidasen katalysiert werden, erhalten. Dabei wird Laktose als Substrat verwendet, und der Galaktoseteil der Laktose auf andere Zucker (Laktose, Galaktose oder auch GOS) übertragen. ?-Galaktosidasen können aber auch für die Bildung von Hetero- Oligosacchariden verwendet werden, etwa durch Übertragung der Galaktose auf Mannose, Fruktose, N-Acetylneuraminsäure oder Glucuronsäure. Durch Auswahl eines gewünschten Akzeptorzuckers und einer geeigneten ?-Galaktosidase können so neue HOS erhalten werden, die für die Anwendung in der Lebensmittelindustrie interessant sind.In Rahmen dieses Projektes befassten wir uns mit der detaillierten Kinetik der Transferaseaktivität unterschiedlicher ?-Galaktosidasen aus Laktobazillen und Bifidobakterien unter Verwendung verschiedener Zuckerakzeptoren. Diese Transferase- aktivität wurde für eine Anzahl unterschiedlicher Enzym / Zuckerkombinationen quantifiziert. Dies ermöglicht die Identifizierung von geeigneten ?-Galaktosidasen für die biokatalytische Umsetzung von Laktose mit z.B. N-Acetylglucosamin, N-Acetylgalactosamin oder Fukose, um neue HOS zu erhalten, die im Vergleich zu GOS neuartige oder verbesserte Funktionalität aufweisen können. Obwohl die prinzipielle Fähigkeit des Galaktosyltransfers auf diese unterschiedlichen Zucker durch ?-Galaktosidasen bereits gezeigt wurde, wurde diese Reaktion noch nie im Detail biochemisch untersucht bzw. quantifiziert. Die Bedeutung unserer Arbeiten liegt also im Verbessern des wissenschaftlichen Verständnisses der Transferaseaktivität unterschiedlicher ?-Galaktosidasen. Damit ist eine Vorhersage der möglichen Produkte dieser Transferaseaktivität, ausgehend von unterschiedlichen Zuckern, möglich, was die maßgeschneiderte Bildung neuer Hetero-Oligosaccharide ermöglicht.