NMR Charakterisierung des Rezeptors 24p3R und dessen Wechselwirkung mit NGAL

Ziel des Forschungsprojektes ist die strukturelle Charakterisierung des zellulären Siderocalin Rezeptor 24p3R und dessen Interaktionsmodus mit dem biologisch/medizinisch bedeutsamen Siderocalin NGAL. Die Besonderheit dieses Proteinkomplexes ist, daß, im Gegensatz zu bisher bekannten Systemen, im gebildeten NGAL/24p3R Komplex der zelluläre Rezeptor seine inhärente strukturelle Flexibilität beibehält. Eine konventionelle Strukturanalyse ist daher nicht möglich. Alternativ wird daher im gegenständlichen Forschungsprojekt, die NMR- Spektroskopie methodisch weiterentwickelt, um sowohl strukturelle als auch dynamische Information zu liefern. Die im Projekt erzielten Ergebnisse und Einsichten sollten zu einem besseren Vertändnis dieser biologisch wichtigen Proteininteraktion führen und, daran anschliessend, als Ausgangspunkt für rationales Wirkstoffdesign dienen können. Siderocaline sind spezifische Eisen-Transportproteine, die sowohl intra- als auch extrazellulär wirksam sind. Ein prototypischer Vertreter dieser Proteinklasse ist das human neutrophil gelatinase associated lipocalin (NGAL). Der reversible Membrantransport ist ursächlich für die biologische Funktion des Proteins und wird durch den zellulären Rezeptor 24p3R gewährleistet. Durch diesen als Endozytose bezeichneten Prozeß reguliert NGAL fundamentale Zellaktivitäten (Differenzierung und Apoptose). Nebst dieser Transportfunktion spielt NGAL auch eine wesentliche Rolle in Tumorprogression und Metastasenbildung. Trotz dieser enormen medizinischen Bedeutung sind die molekularen Ursachen weitgehend unbekannt, nicht zuletzt durch das Fehlen detaillierter Strukturdaten. Eine erste Analyse der Aminosäuresequenz( Primärsequenz) ergab, daß die Integration des Rezeptors 24p3R in die Zellmembran durch 11 Transmembransegmente erfolgt. Die Vorarbeiten zu diesem Projekt lieferten erste strukturelle Informationen über die N-terminale Domäne des Rezeptors und ergaben, daß dieser Teil des Proteins die Interaktionsdomäne mit NGAL enthält und interessanterweise keine definierte räumliche Struktur besitzt, sondern erstaunliche inhärente Mobilität besitzt und diese im Komplex mit seinem authentischen Bindungspartner beibehält. Diese interessante strukturelle Dynamik soll im gegenständlichen Forschungsprojekt genauer untersucht werden. Dazu ist es erforderlich, bestehende NMR-Methodik weiter zu entwickeln und auf diese spezielle wissenschaftliche Fragestellung zu adaptieren. Trotz des enormen Molekulargewichtes des gesamten Rezeptors und den bekannten experimentellen Schwierigkeiten, die in Strukturuntersuchungen von membranständigen Proteinen auftreten, befaßt sich ein Teil des Projektes mit der Untersuchung einer Rezeptorvariante, die sowohl die N- terminale Interaktionsdomäne des Rezeptors als auch einen wesentlichen Teil der Membrandomäne enthält. Dies erlaubt bessere Zusammenfassend beschäftigt sich das Forschungsprojekt mit der Analyse der strukturellen Dynamik des NGAL/24p3R Proteinkomplexes, einem zentralen Bestandteil von zellulären (und medizinisch bedeutsamen) Signalkaskaden. Die im Rahmen des Projektes erarbeiteten Methoden erlauben in Zukunft die Untersuchung von bislang unzugänglichen Proteinsystemen. Die gewonnen strukturellen und dynamischen Daten dienen in weiterer Folge zur rationalen, strukturangeleiteten Entwicklung von Wirkstoffen mit hoher Selektivität und optimalem Aktivitätsprofil.

Ziel dieses Projektes, mittels Kernmagnetresonanz (NMR), war die strukturelle Charakterisierung des Siderocalin Zellrezeptors 24p3R und dessen Interaktionsmodus mit dem biologisch/medizinisch bedeutsamen Siderocalin NGAL. Siderocaline sind spezifische Eisen-Transportproteine, die sowohl intra- als auch extrazellulär wirksam sind. Ein prototypischer Vertreter dieser Proteinklasse ist das human neutrophil gelatinase associated lipocalin (NGAL). Der reversible Membrantransport ist maßgeblich für die biologische Funktion des Proteins und wird durch den zellulären Rezeptor 24p3R gewährleistet. Durch diesen als Endozytose bezeichneten Prozess reguliert NGAL fundamentale Zellaktivitäten (Differenzierung und Apoptose). Nebst dieser Transportfunktion spielt NGAL auch eine wesentliche Rolle in Tumorprogression und Metastasenbildung. 24p3R besteht aus 11 Transmembran-Helices und mehreren großen, löslichen und schlecht strukturierten Segmenten. Im Laufe dieses Projektes haben wir gezeigt, dass die 100 Aminosäure lange extrazelluläre N-terminale Domäne von 24p3R (24p3R-NTD) ein intrinsically disordered protein (IDP) ist. 24p3R-NTD bindet NGAL mit mikromolare Affinität, und die beiden Proteine bilden einen "Fuzzy" -Komplex, wobei NGAL seine Faltung beibehält, aber 24p3R-NTD eine signifikante Strukturänderung aufweist. Diese Art von Komplex ist eher ungewöhnlich, auch für IDPs. Hochmoderne NMR Experimente, in Verbindung mit anderen biophysikalischen Methoden, wurden verwendet, um die Strukturdynamik dieses faszinierenden Komplexes zu enträtseln. Wir nutzten den schnellen Austausch zwischen der freien und gebundenen Form von 24p3R-NTD in Gegenwart von substöchiometrischen Mengen an NGAL (typischerweise 1: 0,1). Wir verwendeten 15N-CPMG-Experimente an dieser Art von Proben, um Informationen über den gebundenen Zustand von 24p3R-NTD zu bestimmen. Mit dieser Methodik konnten wir zeigen, dass mehrere Teile des Rezeptors an der Interaktion mit NGAL beteiligt sind (ein eher ungewöhnliche Eigenschaft eines IDP), und dass 24p3R-NTD mindestens drei unterschiedliche Konformationen im Komplex einnimmt.Zusammenfassend haben wir zu einem besseren Verständnis der Biochemie von NGAL und seines zellulären Rezeptors beigetragen, die zu einem besseren Verständnis der normalen und pathologischen Funktionen von NGAL/24p3R führen und die Potenzialität einer möglichen Intervention von Siderokalen und deren Rezeptoren als Therapieziele ansprechen sollten. Wir haben auch ein Beispiel für eine atypische Wechselwirkung zwischen einem gefalteten Protein und einem IDP bestimmt. Wir haben gezeigt, dass ein eleganter Einsatz unterschiedlicher NMR-Methoden in Verbindung mit anderen biophysikalischen Techniken (ITC, MS) eine eingehende Charakterisierung dieser Art von Komplex ermöglichen kann.