In-vivo induzierte Antigen- Technologie von Aeromonas salmonicida

Die Furunkulose der Fische ist eine bakterielle Infektionskrankheit, die durch Aeromonas salmonicida hervorgerufen wird und für erhebliche negative Auswirkungen auf die industrielle Fischzucht sorgt. Der Erreger A. salmonicida tritt weltweit auf und löst die Krankheit bei vielen Arten von Kalt- und Warmwasserfischen aus. Die Erkrankung kann einen akuten, subakuten oder chronischen Verlauf nehmen und sowohl lokal begrenzt als auch systemisch auftreten. Fische, die eine Infektion überstanden haben, können asymptomatische Überträger des Erregers werden. Im Verlaufe einer Infektion exprimieren die pathogenen Mikroorganismen Gene, die sie befähigen sich an unterschiedliche Umweltbedingungen anzupassen. Verschiedene Virulenzfaktoren und exprimierte Gene von A. salmonicida konnten bereits unter den Standardbedingungen einer in vitro Kultivierung identifiziert werden. Demgegenüber gibt es gegenwärtig keine Anhaltspunkte inwieweit die Expression von Genen des Fischwirts im Verlaufe einer Infektion mit A. salmonicida hochreguliert wird. Ziel des vorgelegten Projekts ist es demgemäss mithilfe der sogenannten "in vivo induced antigen technology (IVIAT)", derartige Gene zu identifizieren. Dazu werden mit dieser immunologischen "screening"-Technik die im Verlaufe einer Infektion neu auftretenden bakteriellen Antigene identifiziert. Dieser experimentelle Ansatz, nämlich in vivo induzierte Antigene nachzuweisen und die ihnen entsprechenden Gene zu identifizieren, stellt eine zukunftsweisende Strategie dar. Damit können neue Virulenzfaktoren bzw. für die Pathogenese relevante Expressionsmuster dargestellt werden. Die Charakterisierung von neuen, an der Pathogenese beteiligten Genen bildet letztlich die Grundlage für diagnostische und therapeutische Anwendungen bzw. für eine Vakzinierung. Darüberhinaus werden auf diese Weise neue Einsichten in den Infektionsmechanismus von A. salmonicida vermittelt.

Aeromonas salmonicida ist ein wichtiger bakterieller Krankheitserreger bei Fischen. Mehrere Unterarten sind beschrieben, die bekannteste Unterart ist A. salmonicida subsp. salmonicida, ein häufiger Erreger bei Salmoniden. Die Erkrankung kann einen akuten, subakuten oder chronischen Verlauf nehmen und Fische, die sich von Furunkulose erholen, können asymptomatische Träger bleiben. Aeromonas salmonicida Infektionen hatten einen besonders signifikanten Einfluss bis in die Mitte der neunziger Jahre, als ein effizienter Impfstoff in der Salmonidenindustrie eingeführt wurde. Jedoch kann dieser Impfstoff schwere Nebenwirkungen bei Fischen haben. Außerdem ist die Einführung neuer wirtschaftlich genutzter Arten, wie Kabeljau oder Heilbutt, ein Problembereich, da widersprüchliche Berichte bezüglich der Wirksamkeit der derzeitigen Impfstoffe existieren.Bakterielle Krankheitserreger regulieren häufig die Expression ihrer Virulenzgene und exprimieren diese nur während des Infektionsprozesses. Dies erschwert oft die Untersuchung der Virulenzfaktoren dieser Bakterien und macht es außerdem unmöglich, Mechanismen hervorzuheben, welche natürlich selektiert wurden und während des Invasionsprozesses überexprimiert werden.Das ist die Grundlage der sogenannten "in vivo induced antigen technology" (IVIAT), welche für die vorliegende Studie verwendet wurde: Antikörper wurden aus Fischen gewonnen, die dem Pathogen ausgesetzt wurden. Diese Antikörper wurden gegen eine in-vitro-Kultur des untersuchten Bakteriums adsorbiert, um diejenigen zu entfernen, die mit in vitro exprimierten Proteinen reagieren, sodass nur Antikörper übrig bleiben, die speziell während des Infektionsprozesses exprimierte Antigene ins Visier nehmen. Diese Antikörper wurden anschließend verwendet um eine Genombibliothek aus 12074 zufälligen Abschnitten des Genoms von A. salmonicida subsp. salmonicida zu screenen. Positive Abschnitte wurden sequenziert und basierend auf Homologie identifiziert. Dieser Ansatz brachte 8 Gene hervor, für die das entsprechende Protein in vivo stärker exprimiert zu sein scheint: UDP-3-O-Acyl-N-Acetylglucosamin-Deacetylase (beteiligt an der Zellwandsynthese), RNA polymerase sigmafactor RpoD (ein Regulator der Genexpression); TonB (liefert Energie für den Transport durch die Zellmembran) dazu der Effektor des Typ-3-Sekretionssystem AopO, Lactoylglutathione Lyase (beteiligt an der Widerstandsfähigkeit gegen pH- und oxidativen Stress), ein LamB-like Maltoporin, sowie zwei hypothetisch konservierte Proteine.Danach wurde eine Reverse-Transkriptions-quantitative-PCR (RT- qPCR) von jedem dieser Gene durchgeführt, welche bestätigt, dass diese Gene während des Infektionsprozesses signifikant höher transkribiert wurden.Dieses Projekt erlaubt uns den Virulenzprozess von Aeromonaceae und ihre Interaktion mit dem Fischwirt besser zu verstehen.