XAS Spektroskopie von tumorhemmenden Ruthenium-Komplexen

Ruthenium-Komplexe sind eine neue Klasse von tumor-inhibierenden Wirkstoffen. KP1019, indazolium-trans- [tetrachlorobis(indazole)ruthenate(III)]), und das analoge Natrium-Komplexsalz KP1339 sind solche Substanzen. KP1339 befindet sich seit 2009 in der klinischen Phase I in Krebsforschungszentren in Großbritannien und den USA. Weder die genaue Koordination, noch der Redoxzustand dieser Verbindungen in biologischen Gewebe wurde bisher eindeutig geklärt. Damit fehlt ein grundlegendes Verständnis der antitumoralen Wirkung, das wichtig für die Entwicklung bzw. Weiterentwicklung von wirkungsvollen Ru-Komplexen ist. Durch das bessere Verständnis der Oxidations- und Koordinationszustände im Tumorgewebe und des damit verbundenen Wirkmechanismus werden weitere Impulse für eine pharmakologische Optimierung von KP1339 erwartet. Das Projekt soll einen Beitrag zum grundlegenden molekularen Verständnis des Einflusses von Ru-Komplexen auf zelluläre Ereignisse leisten. Zur Analyse der Ru-Koordination soll die Röntgenabsorptionsspektroskopie (XAS) eingesetzt werden, die als Methode zur Aufklärung der Struktur von Metallkoordinationszentren einen hohen Stellenwert besitzt. Nach Komplettierung der XAS-Datenbank mit biomimetischen Ruthenium-Komplexen soll die Koordination von KP1019 und KP1339 in der Zelle und deren Kompartimenten untersucht werden. Der vorgeschlagene Wirkmechanismus von Ru über die Proteine Albumin, Transferrin und der mögliche Einfluß des Tripeptids Glutathion sollen untersucht werden. Dies wird unter Zuhilfenahme von geeigneten Test- oder Modellsystemen und dem anschließenden Vergleich mit XAS-Spektren verschiedener Fraktionen des Zellaufschlusses erfolgen. Da Transferrin mit hoher Wahrscheinlichkeit maßgeblich am Transport von Ru in die Zelle beteiligt ist, soll apo-Transferrin in Verbindung mit KP1339 cokristallisiert und im Anschluß die Struktur mittels Röntgendiffraktion aufgeklärt werden. Der angenommene Mechanismus der Ru-Verbindungen (Aktivierung durch Reduktion) soll mittels Nahkanten-XAS untersucht werden. Die mikro-XAS-Methode wird angewandt um die Verteilung der Ru-Verbindungen in der Zelle und in den einzelnen Zellkompartimenten darzustellen. An ausgewählten Punkten der mikro-XAS-Aufnahmen wird durch zusätzliche Messung von konventionellen XAS-Spektren eine Bestimmung der Koordination von Ru in diesem Bereich erfolgen. Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen XAS-Methoden sollen durch Transmissions-rasterröntgenmikroskopie (STXM) der Oxidationszustand und die Koordination von Ru in subzellulären Kompartimenten untersucht werden. Die Ergebnisse dieser Studie werden es erlauben eine Aussage darüber zu machen, wie das Therapeutikum innerhalb der Zelle gebunden ist und mit welchen Zellorganellen es interagiert.

Rutheniumverbindungen gehören zu den vielversprechendsten Metallkomplexen für die Krebstherapie. Diese zeigen eine Anti-Tumor-Aktivität, die häufig die von anderen zytostatischen Mitteln überschreitet (z. B. in kolorektalen Karzinomen und einer Vielzahl von primär explantierten menschlichen Tumoren in vitro). Im Vergleich zu Pt-Verbindungen verursachen KP1019 und KP1339 weniger Nebenwirkungen und Resistenzen gegen das Medikament sind weniger wahrscheinlich. Das chemische und pharmakokinetische Verhalten von Ru unterscheidet sich von Pt-Verbindungen, wie in umfangreichen Proteinbindungsstudien in vivo gezeigt wurde. Die Ru-Komplexe KP1019 (Indazolium-trans-[tetrachloridobis(indazol)ruthenat(III)], sein Na-Salz-Analogon KP1339, waren das Untersuchungsobjekt. KP1019 und KP1339 bestehen aus Ru(III), koordiniert durch 2 Stickstoff- und 4 Chloridliganden, als Ru(III)N2Cl4 abgekürzt. Weder die genaue Koordination noch der Oxidationszustand der Biotransfomationsprodunkte dieser Verbindungen in Geweben sind bisher eindeutig geklärt. Daher fehlt ein fundamentales Wissen über die Antitumorwirkung, das für die weitere Entwicklung neuer Rutheniumkomplexe wichtig ist, wobei zu berücksichtigen ist, dass eine Aktivierung durch Reduktion diskutiert wird. Die XANES-Analyse von KP1019 unter in vitro-Bedingungen legt den Austausch eines Cl-Liganden durch ein aus der Pufferlösung stammendes O-Atom oder ein N-Atom aus dem deprotonierten Indazolium-Gegenkation nahe. XANES-Spektren, gemessen an Leber- und Tumorproben aus Mäusen, die mit KP1019 bzw. KP1339 behandelt wurden, zeigten identische erste Koordinationsumgebungen in vivo. Ru bleibt in der Oxidationsstufe (+III). Die Ergebnisse waren unabhängig von den getesteten Dosierungen. Die Mikroproben-Röntgenfluoreszenz von Tumordünnschnitten zeigte das starke Eindringen von Ruthenium in das Tumorgewebe mit den höchsten Konzentrationen in der Nähe von Blutgefäßen und in den Randbereichen der Gewebeproben.Der vorgeschlagene Anreicherungsmechanismus von Ru über das Protein Albumin wurde untersucht indem Humanserumalbumin mit KP1019 co-kristallisiert und die Struktur durch Einkristall-Röntgenbeugung bestimmt wurde. Die Strukturdaten zeigten die Bindung von zwei Rutheniumionen an Histidinreste, die beide innerhalb bekannter hydrophober Bindungstaschen von Albumin liegen. Die Rutheniumzentren sind oktaedrisch durch Lösungsmittelmoleküle koordiniert, die die Dissoziation beider Indazolliganden implizieren. Unsere Gruppe schlägt jedoch einen Bindungsmechanismus vor, der die Bedeutung der Indazol-Liganden für die Bindungsstellenerkennung und damit deren unverzichtbare Rolle für die Bindung von KP1019 annimmt.