Molekulare Stressantwort bei Cd-Metallothionein-Genen

Der folgende Projektantrag verfolgt zwei Ziele: Erstens, die Identifizierung Stress-relevanter Transkriptionsfaktoren und ihrer DNA-spezifischen Bindungselemente im Cd-Metallothioneingen von Helix pomatia; zweitens, die Überprüfung der Hypothese, wonach zwei Repeat-Kassetten im Intronbereich dieses Gens als regulatorische Einheiten bei der Stress-abhängigen Transkription in Frage kommen. Organismen reagieren auf Umweltstress durch Aktivierung spezifischer Signaltransduktions-Kaskaden, in deren Verlauf es zur Transkription sogenannter Stressgene kommt. Deren Regulation erfolgt dabei häufig unter Beteiligung von Stress-abhängigen Transkriptionsfaktoren, die an bestimmte Erkennungssequenzen in der DNA der betreffenden Gene binden. Derartige Mechanismen wurden im Verlauf der letzten Jahre unter anderem bei Metallothioneinen (MTs) aufgeklärt. So sind MTs und deren Gene beispielsweise in die homöostatische Regulation und Entgiftung metallischer Spurenelemente involviert, spielen aber auch eine Rolle bei der zellulären Radikalentgiftung und bei der Bewältigung von Umweltstress-Faktoren. Leider konzentrierten sich bisherige Untersuchungen dabei hauptsächlich auf einige wenige Vertebraten-Arten und Modellorganismen. Dabei scheint vor allem ein Transkriptionsfaktor eine zentrale Rolle zu spielen, der als "Metal Responsive Transcription Factor- 1" (MTF-1) bezeichnet wird. Im Gegensatz dazu kennt man die entsprechenden Mechanismen der Stress-abhängigen Transkription von MT- Genen bei Organismen, die nicht als Modellsysteme fungieren oder bei Tiergruppen, die mit Vertebraten nur sehr weitläufig verwandt sind, bisher überhaupt nicht. So gehören etwa Gastropoden zum Superphylum der sogenannten Lophotrochozoa, für die es keinen erprobten Modellorganismus gibt. Wir konnten in unseren bisherigen Untersuchungen zeigen, dass die Gene für das Cadmium-MT (CdMT) bei terrestrischen Pulmonaten (z.B. Helix pomatia) in ihrer Promotor-Region und in ihren Introns hochgeordnete Repeat-Kassetten enthalten, die aus Bindungsstellen für Stress-abhängige Transkriptionsfaktoren in Frage kommen. Wir vermuten, dass die Tiere dadurch in der Lage sind, ihre molekulare Stressantwort flexibel zu regulieren. Das Hauptziel des vorliegenden Projektantrages besteht deshalb darin, die Aktivierung des CdMT-Gens von Helix pomatia unter Einwirkung metallischer und nicht-metallischer Stressoren zu untersuchen. Zum einen sollen dabei die Identität und Stress- abhängige Bindung der involvierten Transkriptionsfaktoren an DNA-Bindungselemente in der Promotor-Region dieses Gens untersucht werden. Dies soll mit Hilfe des DNase I-Footprintings an cytosolischen und nukleären Mitteldarmdrüsen-Exktrakten unterschiedlich gestresster Individuen erreicht werden. Diese Studien sollen durch elektrophoretische Bindungsanalysen (EMSA) ergänzt werden. Die Isolierung und Identifizierung bislang unbekannter Transkriptionsfaktoren soll mit Hilfe von generierten DNA-Probes in Kombination mit einem immunologisch-magnetischen Anreicherungs-Verfahren (sogenannter "Dynabeads") und Protein-chemischen Analysen erfolgen. In Ergänzung dazu soll ein "yeast one-hybrid"-Screeningtest zum Einsatz kommen, bei dem kurze, vielversprechende DNA-Bindungselemente in Hefezellen kloniert werden, an die entsprechende Transkriptionsfaktoren binden können, die aus einer cDNA-Bibliothek gestresster Weinbergschnecken generiert und in den Hefezellen durch Kotransformation exprimiert werden. Zum anderen sollen Repeatkassetten mit vermuteter regulatorischer Funktion aus dem Intron des Cd-MT-Gens der Weinbergschnecke in geeignete Reportergen-Konstrukte eingebaut werden, deren Transkription vom zugehörigen Cd-MT-Promotor kontrolliert wird. Die Funktionalität dieser Konstrukte soll durch transiente Transfektion in Zellkulturen von Drosophila melanogaster (SL2) and der Maus (NIH 3T3) überprüft werden. Wir erwarten uns aus der Beantwortung dieser Fragestellungen ein besseres Verständnis der Mechanismen der MT- Induktion bei Gastropoden. Darüber hinaus sollen die Ergebnisse unserer Untersuchungen zu einer Vertiefung unseres Wissens über die molekulare Anpassung terrestrischer Gastropoden an ihren Lebensraum führen. Schließlich hoffen wir, dass die Ergebnisse unserer Arbeit zu einer kritischeren Haltung bei der Verwendung von MTs als Biomarker im Umwelt-Monitoring führen können.

Landlungenschnecken gehören zur Weichtier-Klasse der Gastropoden, die im Lauf der Evolution aus marinen Lebensräumen heraus terrestrische Habitate besiedelt haben. Der Schlüssel zum Verständnis für diese erfolgreiche Anpassung liegt in der hohen Stress-Toleranz von Landlungenschnecken und deren Fähigkeit, wechselhaften mikroklimatischen Einflüssen, sowie sich rasch verändernden Umweltbedingungen, wie sie in terrestrischen Lebensräumen vorherrschen können, zu trotzen. Landlungenschnecken können sich dabei auf ein Netzwerk Stress-reaktiver Genen verlassen, die für zellulären Schutz, Stress-Abwehr und Reparaturprozesse zuständig sind. Besonders wichtig ist in diesem Zusammenhang die Aufrechterhaltung der zell-internen Metall-Homöostase. So besitzen z.B. terrestrische Heliciden ein Cd-spezifisches Metallothionein-Gen (CdMT), dessen Genprodukt toxische Cd2+-Ionen selektiv bindet und entgiftet. Auch bei Vertebraten können MT-Gene durch Stressfaktoren auf-reguliert werden, wobei das entsprechende Protein nicht nur an der Entgiftung und Homöostase von Metallen beteiligt ist, sondern auch andere zelluläre Schutzfunktionen übernimmt. Über die Mechanismen der Regulation von MT-Genen bei Gastropoden wusste man bislang kaum Bescheid.Das Hauptziel des vorliegenden Projektantrages bestand deshalb darin, die Aktivierung des CdMT-Gens terrestrischer Heliciden-Arten unter Einwirkung metallischer und nicht-metallischer Stressoren zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass das CdMT-Gen terrestrischer Heliciden zwar vorwiegend durch Cd-Belastung induziert wird; daneben kann auch physiologischer Stress (z.B. Trockenstress) zu einer geringfügigen Induktion dieses Gens führen. Die Transkriptions-Aktivität des CdMT-Gens ist jedoch bei Landschnecken individuell variabel und hängt unter anderem vom physiologischen Ernährungszustand und der tageszeitlichen Aktivität der Tiere, sowie vom jeweiligen Entwicklungsstadium (embryonal / adult) ab. Wie die meisten anderen MT-Gene, besitzt auch das CdMT-Gen terrestrischer Heliciden in der Promotor-Region konservierte Erkennungs-Sequenzen, die als Metal Responsive Elements (MREs) bezeichnet werden. Wir konnten mit Hilfe von DNaseI Footprinting in Kombination mit EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) nachweisen, dass alle vier MREs in der Promotor-Region des CdMT-Gens der Weinbergschnecke funktional sind, wenngleich die nur geringfügigen Unterschiede in der Aktivierung der MREs zischen Kontrolltieren und Cd-belasteten Individuen auf einen wenig spezifischen Induktionsmechanismus hindeuten. Bis vor kurzem war der für die Metall- und Stress-abhängige Induktion von MT-Genen bei Vertebraten zuständige Transkriptionsfaktor MTF-1 (Metal Responsive Transcription Factor 1) bei Gastropoden unbekannt. Unsere neuesten Transkritpom-Analysen zeigen jedoch, dass zumindest einige Gastropodenarten ein zum MTF-1 der Vertebraten orthologes Gen besitzen, wenngleich dessen Rolle bei der Induktion von MT-Genen, sowie seine Präsenz im Genom der Weinbergschnecke noch unklar sind. Laufende Untersuchungen werden hoffentlich bald mehr Klarheit dazu bringen. Jedenfalls bestätigen unsere Untersuchungen die Nützlichkeit und Notwendigkeit, molekulare Mechanismen der Stressabwehr bei Tiergruppen, die nicht als klassischer Modellorganismen gelten, vergleichend zu untersuchen.