Wassertransport durch den Natrium-Glukose-Cotransporter

Nach mehr als einem Jahrhundert intensiver Erforschung des epithelialen Transports ist die Frage, ob es sekundär aktive Wassertransporter gibt, noch immer umstritten. Mit der Untersuchung des Wassertransports durch Natrium- Glukose-Cotransporter (SGLT1) exprimierende Zellmonoschichten möchten wir zur Klärung beitragen. Wenn sich Berichte über den Cotransport von 250 Wassermolekülen per Glukosemolekül bestätigen, werden wir, ungeachtet eines fehlenden oder entgegengesetzt gerichteten osmotisch Gradienten, in Anwesenheit eines Glukose- oder Natriumgradienten einen Wasserfluss registrieren können. Die speziell für derartige Experimente entwickelte Kombination aus elektrochemischer Rastersondenmikroskopie und Fluoreszenztechniken erlaubt die gleichzeitige Aufzeichnung von Wasser-, Natrium- und Glukosefluss, was die Bestimmung der SGLT1-Transportstoichiometry in nativer Umgebung ermöglicht. Darüber hinaus führen wir genetisch kodierte Fluoreszenzmakierungen in das SGLT1 Molekül ein, die die Bestimmung der Transporterdichte in der Plasmamembran mittels Fluoreszenzkorrelationspektroskopie (FCS) und damit die Erfassung der Anzahl der die SGLT1-Pore passierenden Wassermoleküle mit bisher nicht erreichter Genauigkeit ermöglicht. Mittels Mutationsanalyse grenzen wir die Pore vom Glukosetransportweg ab und testen u.a. durch die Registrierung von Photonzahlhistogrammen, ob die Pore durch Oligomersation des Transporters entsteht. Messungen kleinster Unterschiede in der epithelnahen Ionenkonzentration mit elektrochemischer Rastersondenmikroskopie werden erlauben, die zur stoichiometrischen Kopplung alternative Theorie zu prüfen, dass die Kopplung zwischen Lösungsmitteltransport und Wassertransport aufgrund lokaler Osmose in der ungerührte Schicht stattfindet. Neben neuen Methoden für die Untersuchung Wassertransports kommen auch etablierte Methoden, wie die der Messung des transepithelialen Widerstandes oder die der Erfassung des parazellulären makromolekularen Flusses zum Einsatz. In Kombination mit FCS bietet uns die konfokale Laser-Rastermikroskopie die Möglichkeit, sowohl den transzellulären Wasserfluss anhand der räumlicher Konzentrations- und Mobilitätsunterschiede intrazellulärer Fluoreszenzsonden zu analysieren, als auch die hypothetische Rolle des Zytoskeletts für die Regulation der Flussgeschwindigkeit zu untersuchen.

Der Mensch resorbiert aus dem Dünndarm ca. 8-10 l Wasser täglich. Es handelt sich hierbei nur in geringem Maße um Wasser, das mit der Nahrung aufgenommen wird. Vielmehrentstammt dieses Wasser körpereigenen Drüsen, d.h. es ist vornehmlich Bestandteil von Speichel oder Magensaft. Bisher war unklar, wie das Wasser aus dem Dünndarm ins Blut gelangt. Stark wasserleitende Kanalproteine (sogenannte Aquaporine), wie sie beispielsweise aus der Niere bekannt sind, fehlen im Dünndarmepithel. Wir haben jetzt gezeigt, dass ein anderes Eiweiß die Rolle des wasserleitenden Kanals übernehmen kann. Von diesem Eiweiß, dem sogenannten Natrium Glukosekotransporter, wusste man bisher nur, dass es für die Aufnahme von Glukose aus dem Dünndarm zuständig ist. Der Umstand, dass es Wasser genauso schnell leitet wie die, in der Niere vorkommenden Aquaporine war bisher unbekannt. Wir haben die Permeabilität für Wasser auf zwei verschiedene Arten nachgewiesen: zum einen haben wir epitheliale Zellen auf Filtern zu Monoschichten herangezogen und zum anderen haben wir das Protein aus Zellen gereinigt und in Lipidvesikel (Liposomen) eingebaut. Die epithelialen Zellen waren genetisch derart modifiziert, dass sie große Mengen einer fluoreszierenden Variante des Eiweißes in ihrer Zellmembran enthielten. Dadurch war es möglich, die Konzentration des Proteins in der Membran exakt zu erfassen. Die gleichzeitige Messung der Wassermenge, die sowohl Zellmonoschicht als auch Filter passiert hat, ermöglichte die Berechnung der Wasserleitfähigkeit eines einzelnen Proteinmoleküls. Die gleiche Wasserleitfähigkeit haben wir aus der Messung der Geschwindigkeit erhalten, mit der die Vesikel schrumpfen, wenn sie einem osmotischen Druck ausgesetzt werden. Für die zeitabhängige Messung des Vesikelvolumens haben wir Änderungen in der Lichtstreuintensität ausgewertet und die Anzahl der Proteine pro Vesikel mittels Fluoreszenz erfasst. Aus der Tatsache, dass eine Erhöhung der Glucosemenge im Medium zu einer Reduktion der Wasserleitfähigkeit führt, haben wir geschlussfolgert, das Wasser und Glucose denselben Weg durch das Protein nehmen. Der Effekt war nach Mutation der Bindungstasche von Glukose nahezu verschwunden, da infolge schwächerer Bindung die Glukosemoleküle nur in geringem Maße eine Verjüngung des ohnehin schon engen Wasserweges herbeigeführt haben. Aufgrund der Erkenntnis, dass der Natrium Glucosecotransporter eine wichtige Wasserroute darstellt, gewinnt der Transporter als Zielobjekt von Arzneistoffen zur Regulierung des Wasserhaushaltes an Bedeutung.