Modulation von Wachstum und Bildung von Sekundärstoffen bei Flechten unter stress

Viele Organismen, die hochwertige chemische Verbindungen enthalten, sind oftmals schwer zu kultivieren oder es handelt sich um bedrohte Arten, die durch übermäßiges Ernten aussterben könnten. Da Flechten im allgemeinen langsam wachsende Organismen sind, ist die Extraktion von Metaboliten aus den natürlich gewachsenen, zusammengesetzten Thalli in vielen Fällen wirtschaftlich nicht gewinnbringend und wird deshalb auch nur beschränkt angewandt. Mykobionten-Kulturen stellen zum Extrahieren von Flechtenstoffen eine attraktive Alternative im Vergleich zu den Thalli vom natürlichen Standort, dar. Das Labor der Projektwerberin an der Universität Salzburg besitzt eine weltweit für Forschungszwecke anerkannte, und auch für Europa einmalige Kultursammlung mit 150 verschiedenen Flechtenpilzen. Die Modulation ("regulative Manipulation") der Wachstumsbedingungen von Mikroorganismen und Pilzen ist eine in der Biotechnologie und der Mikrobiologie häufig angewandte Strategie, um Erträge und Vielfalt von Sekundär-Metaboliten mit hohem therapeutischen Wert zu verbessern. Das Interesse an Polyketid-Typ Metaboliten ist beträchtlich, da viele dieser Naturstoffe eine große medizinische, industrielle und/oder landwirtschaftliche Bedeutung haben. In Fallstudien haben wir bereits begonnen, die "Wachstums- und Kulturbedingungen" für Flechtenpilze regulativ zu beeinflussen. Wir haben die Kulturbedingungen für einige ausgewählte Flechtenpilze (z.B. Roccella decipiens, Arten der Gattung Xanthoparmelia) bereits erfolgreich optimiert, wobei sie in einer von unseren Kulturkammern genau definierten Umweltbedingungen ausgesetzt werden. In zukünftigen und bereits laufenden Untersuchungen wollen wir weitere Strategien der Kultur-Optimierung testen. Dadurch wird es möglich sein, axenisch gewachsene, kultivierte Mykobionten zu "modulieren", dass sie entweder einzelne Sekundärstoffe oder ein komplettes Metaboliten-Muster ausbilden. Polyketide und Shikimat-Derivate, so konnte und soll gezeigt werden, werden nur unter "erlaubten" ökologischen Bedingungen und mitunter nur unter Stress (z.B. Austrocknungsstress) gebildet. Indem wir das Wissen von früheren Untersuchungen nutzen, und im geplanten Projekt weitere umfangreiche Testserien starten wollen, könnten wir die Produktion von einem bestimmten Polyketid erreichen oder sogar die Produktion eines bestimmten Musters von Polyketiden vorhersagen. Solche Studien sind sehr hilfreich, um die oftmals beobachtete Variation von Sekundär-Metaboliten (chemosyndromische Variation) in einer Flechte/Population, die unter heterogenen Bedingungen gewachsen ist, im Detail erklären zu können. Variationen in der Sekundärstoff-Chemie wiederspiegeln schließlich die mannigfachen Antworten des Organismus Flechte auf physiologische, ökologische und mitunter sogar evolutionäre Veränderungen in der Umgebung und den Klimabedingungen. Die beliebig wiederholbare und in-vitro Produktion von größeren Mengen von Flechten-Metaboliten in Pilz-Zellkulturen hat in unserem Labor bereits begonnen und könnte in naher Zukunft ein wichtiger Meilenstein werden, um die Architektur, Lokalisierung und die Funktion der Polyketid-Synthase-Gene, die die Polyketid-Biosynthese kontrollieren, aufzuklären. Zusätzlich sollen noch unbekannte Gene aufgespürt werden, die an der Shikimat-Derivat Biosynthese beteiligt sind, ganz aufzuklären. In einem neuartigen und holistischen Ansatz sollen Methoden der Funktionellen Genomik (Konstruktion einer cDNA Bibliothek) zum Einsatz kommen, um die molekularen Mechanismen, die an der Austrocknungstoleranz vieler Flechten (z.B. Xanthoparmelia conspersa) beteiligt sind, näher zu untersuchen . Wir planen, "trancriptome-Sampling" durchzuführen, um " neue Gene", die für die Kontrolle bestimmter ökophysiologischer Prozesse und die Bewältigung von Stress verantwortlich sind, zu identifizieren.

Da die meisten Flechten langsam wachsende Organismen sind, ist die Extraktion von wertvollen, biologisch aktiven Sekundärstoffen aus den in der Natur vorkommenden Lagern (wurde 2016 als eine Symbiose aus 2 Pilzen und Algen erkannt) wirtschaftlich nicht gewinnbringend und wird/wurde deshalb bisher nur in geringem Umfang, wie z.B. in der Parfüm-Industrie, durchgeführt.Ziel des Projektes war es, als Alternative zu den natürlich gewachsenen Flechtenthalli isolierte und kultivierte Pilzreinkulturen einzusetzen, die durch regulative Beeinflussung (Modulation) der Wachstums- und Kulturbedingungen zu höheren Ausbeuten und zu einer größeren Vielfalt an Sekundärmetaboliten führen können. Da es sich bei den Sekundärmetaboliten der Flechten vorwiegend um Polyketide und in einigen Fällen um interessante Shikimat/Pulvinsäure-Derivate handelt (letztere wirken oftmals als effektive Sonnenfilter an exponierten Felsstandorten), die eine nachgewiesen potentielle medizinische und industrielle Anwendung finden könnten, zeigten unsere Testserien, vor allem mit ausgewählten Xanthoparmelia-Arten diesbezüglich sehr interessante Ergebnisse. Mit neuen Nährstoff-Kombinationen in den Kulturmedien und genau definierten, mikroklimatischen Bedingungen in den Kulturschränken (Simulation von Austrocknungsstress und Temperatur-fluktuationen) gelang es, größere Mengen an Xanthoparmelia- Flechtenpilzen heranzuziehen, die entweder einzelne oder komplexe, jedoch auch komplette Sekundärstoff-muster ausbildeten. Besonders die Xanthoparmelia-Arten, die unter semiariden Bedingungen in Australien gewachsen waren, zeigten ein besonders hohes Ausmaß an sogenannter chemo-syndromischer Variation. Dabei werden unter gezieltem Einfluss von Stress z.T. bestimmte Hauptsubstanzen zu Neben/Satellitensubstanzen und umgekehrt. Bei Veränderung der Umweltbedingungen und der Kohlenhydratzufuhr in den Nährmedien konnten in den Kulturschränken an den kultivierten Flechtenpilzen ähnliche Sekundärstoffmuster wie bei den in der Natur gewachsenen Thalli beobachtet werden. Es zeigte sich, dass bei den ausgewählten Pilzen die Ausbildung von bestimmten Chemosyndromen tatsächlich durch Trockenstress und ein geringes Angebot an Nährstoffen aus dem Kulturmedium beeinflusst werden können, was unsere Testserien das erste Mal direkt bewiesen haben. Aus der Sicht der Projektleiterin ist das ein wesentlicher Meilenstein, um chemosydromische Variationen in ihrem Auftreten in bestimmten Flechten-Arten (z.B. Xanthoparmelien) an den verschiedenen Standorten unter gegebenen ökologischen Bedingungen besser interpretieren und verstehen zu können. In weiterer Folge gelang es, die Architektur, Lokalisierung und die Funktion der Polyketid-Synthase-Gene, die die Polyketid-Biosynthese bei ausgewählten Xanthoparmelia-Arten kontrollieren, aufzuklären. Die Suche nach den Trockenresistenz-Genen, die im letzten Teil des Projekts begonnen wurde, ist noch nicht abgeschlossen und soll in einem geplanten Nachfolge-Projekt fortgesetzt werden.