Kontrolle von SVC und CyHV-3 mit Hilfe von RNAi

Virale Infektionen verursachen tödliche Erkrankungen der Karpfenartigen Fische mit schwerwiegenden wirtschaftlichen Folgen. Beispielsweise verursachen das RNA Virus, Spring Viremia of Carp Virus (SVCV) und das DNA Virus, Cyprinid Herpes Virus-3 (CyHV-3) schwere Erkrankungen, die zudem anzeigepflichtig sind. Beide Erkrankungen führen bei Speise- und Zierfischen zu hohen Verlusten, die sich wirtschaftlich signifikant auswirken. Die Verhütung und Bekämpfung viraler Infektionen in der Aquakultur ist schwierig, weil weder antivirale Arzneistoffe noch wirksame Impfstoffe zur Verfügung stehen. Deshalb sind neue effektive Therapieansätze dringend nötig, damit virale Infektionen der Cypriniden gezielt behandelt und bekämpft werden können. Eine neuartige Technologie in diesem Zusammenhang ist die so genannte RNA Interferenz (RNAi). Darunter versteht man einen konservierten, zelleigenen Mechanismus der zum posttranscriptional gene silencing (PTGS) führt und weit verbreitet bei Pflanzen, Pilzen und Tieren vorkommt. Neuere Untersuchungen zeigten, dass die Verwendung von small interfering RNAs (siRNAs) zur Blockierung der Expression viraler Gene bzw. von Wirtsgenen, die relevant für die Erkrankung sind, eine Virusinfektion eindämmen können. Mithilfe der RNAi- Technologie und der damit verbunden Verbesserung von Techniken um die Expression von Genen zu unterdrücken, wird es möglich sein, Arzneistoffe auf der Grundlage von siRNAs zu entwickeln. Damit sind mit Sicherheit große Fortschritte in der Prävention und Behandlung von Virusinfektionen bei Fischen zu erwarten. Ziel des Projekts ist es mithilfe der RNAi-Technologie die Expression von Genen zu unterbinden, die für die Replikation von SVCV und CyHV-3 von zentraler Bedeutung sind. Die Überprüfung, ob die Expression der Zielgene erfolgreich blockiert wurde, ist im Rahmen des Projekts, methodisch mit quantitativer Real-Time PCR vorgesehen. Auf diese Weise soll ein entscheidender Beitrag zur Bekämpfung dieser viralen Krankheiten geliefert werden.

Die Kontrolle viraler Infektionen ist schwierig und komplex, weil antivirale Mittel zur Behandlung von viralen Erkrankungen bei Nutzfischen nicht verfügbar sind. Aus diesem Grund wurde im vorliegenden Projekt die Technologie der RNA-vermittelten Interferenz (RNAi) angewandt, um Infektionen durch zwei wichtige Fischviren, nämlich das Spring Viraemia of Carp (SVC) Virus und das Cyprinide Herpes Virus-3 (CyHV-3), zu bekämpfen. Die Expression relevanter Gene wurden in jedem Virus mit spezifischen siRNA Oligonukleotiden gezielt unterdrückt. Das Ausmaß der verringerten Expression wurde quantitativ mit Hilfe der realtime-PCR (qPCR) Technik untersucht. Synthetische siRNA-Moleküle wurden entwickelt, um die Transkription des SVCV-Nukleoproteins und des SVCV-Phosphoproteins und somit die Replikation von SVCV in Epithelioma papulosum cyprini (EPC)-Zellen, zu hemmen. Es zeigte sich, dass die gleichzeitige Verwendung beider siRNAs, gerichtet sowohl gegen die Genexpression des Phosphoproteins als auch des Nukleoproteins, am deutlichsten eine Verringerung der Replikation von SVCV bewirkte. In ähnlicher Weise wurden auch siRNA Oligonukleotide getestet, um die in vitro Replikation von CyHV-3 in einer Gehirn-Zelllinie (CCB), die vom Karpfen stammt, zu hemmen. Als Zielpunkte der siRNA-Moleküle dienen hierbei die Genexpression von Thymidinkinase (TK) bzw. von DNA-Polymerase (DP). Beide sind maßgeblich an der Replikation der Viren beteiligt. In beiden Fällen war nach Behandlung mit der jeweiligen siRNA eine verringerte Freisetzung der Viruspartikel aus infizierten CCB-Zellen zu beobachten, wobei, wie die Ergebnisse der qPCR zeigten, die Unterdrückung der Genexpression der DNA Polymerase einen stärkeren Effekt auf die Verringerung der Virusausscheidung hatte. Weitere Arbeiten sollten nun in vivo erfolgen, um die Möglichkeit der Anwendung von RNAi zur Hemmung der Replikation von SVCV und CyHV.3 in infizierten Fischen zu untersuchen.