Expression und Funktion einer neuen Skelettmuskel Kalziumkanal Splice-Variante

Im Skelettmuskel aktiviert der Spannungs-aktivierte Kalziumkanal (Ca V 1.1) die Freisetzung von Kalzium aus dem Sarcoplasmatischen Reticulum und somit die Kontraktion. Dabei spielt der Kalziumeinstrom durch den Kanal keine Rolle. Im Gegensatz, dieser besitzt eine geringe Amplitude, langsame Aktivierungskinetik und ist relativ unempfindlich gegenüber Spannungsänderungen. Jüngst isolierten wir das Transkript einer neuen CaV 1.1 Splice- Variante ohne Exon 29 [Tuluc et al,. 2009]. Im Gegensatz zu den Stromeigenschaften des klassischen CaV 1.1 Kanals, aktivierte die CaV 1.1E29 Isoform bereits bei 30 mV geringeren Membranspannungen einen achtfach stärkeren Kalziumstrom. Während der CaV 1.1E29 Kanal im reifen Muskel lediglich in geringen Mengen exprimiert ist, ist er die dominierende Splice-Variante in embryonalen und kultivierten Muskelzellen. Dies legt nahe, dass CaV 1.1E29 die embryonale Kalziumkanal Isoform des Skelettmuskels darstellt. Weiters deuten die biophysikalischen Eigenschaften und das Expressionsmuster darauf hin, dass CaV 1.1E29 für den Erregungs- gekoppelten Kalziumeinstrom (ECCE) verantwortlich ist, und somit auch an der Entstehung von Maligner Hyperthermie und Central Core Disease beteiligt sein könnte. Daher wollen wir im vorliegenden Projekt die Expression und Funktion des CaV 1.1E29 Kalziumkanals in gesunden und verletzten Muskeln untersuchen. Mit quantitativer RT-PCR und in situ Hybridisierung soll die Expression von CaV 1.1E29 im embryonalen, alternden, denervierten, verletzten und regenerierenden Muskeln bestimmt werden. Ein spezifischer Antikörper gegen die Exon 28/30 Grenze soll hergestellt werden, um den Nachweis des CaV 1.1E29 Proteins in Extrakten und Schnitten von embryonalen Muskeln zu ermöglichen. Der Nachweis der funktionellen Expression von CaV 1.1E29 und die detaillierte Beschreibung seiner biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften soll mit elektrophysiologischen Analysen (Ganz-Zell und Einzelkanal Ableitungen), mit Messungen des intrazellulären Kalziums und mit spezifischen Pharmaka erbracht werden. Um letztlich die physiologische Bedeutung des Isoform- Wechsels von CaV 1.1E29 zu CaV 1.1 während der frühen Entwicklung von Säugern zu entschlüsseln, soll eine Exon 29 knockout Maus erzeugt werden. Schließlich erlaubt unser Befund, wonach Exon 29 für die charakteristischen Stromeigenschaften von CaV 1.1 essentiell ist, neue Vorhersagen zur strukturellen Grundlage seiner Aktivierungseigenschaften. Diese können nun mittels mutierter und chimärer Kanalkonstrukte in dysgenen (Ca V 1.1-/-) Muskelzellen untersucht werden sollen. Die Beantwortung all dieser Fragen ist von großer Bedeutung für unser Verständnis der Skelettmuskelphysiologie, und kann erwartungsgemäß neue Funktionen des Kalziumkanals während der Entwicklung enthüllen.

Die Muskelkontraktion wird auf einen neuronalen Reiz hin durch spannungsaktivierte Kalziumkanäle gesteuert. Paradoxer weise funktioniert der Kalziumkanal im reifen Skelettmuskel nicht als Kanal, sondern als Spannungssensor für die Freisetzung intrazellulären Kalziums. Dies unterscheidet sich vom embryonalen Muskel, wo wir eine Kanalvariante entdeckten, die sowohl als Spannungssensor als auch als Kalziumkanal funktioniert. Offensichtlich schalten Skelettmuskeln während der Entwicklung von einem Kalzium-leitenden, auf einen nicht leitenden Kanal um. Die Frage nach der physiologischen Bedeutung dafür war bisher ungelöst. Allerdings scheint Kalzium- Einstrom schädlich zu sein, da die embryonale, Kalzium-leitende Kanalvariante bei gewissen Formen von Muskelschwäche (Myotone Dystrophie) wieder in Erscheinung tritt. Hier untersuchten wir diese Frage, indem wir eine genetisch veränderte Maus herstellten, die nach der Geburt nicht auf den nicht-leitenden Kanal umstellt, sondern weiterhin die Kalzium-leitende, embryonale Kanalvariante exprimiert. Wenn dieses Umschalten in normalen Muskeln von physiologischer Bedeutung ist, dann sollte die genetisch veränderte Maus eine veränderte Muskelfunktion zeigen. Andererseits, wenn Kalziumeinstrom im reifen Muskel ausreicht um Muskelerkrankung auszulösen, sollte dies in unserem Mausmodell sichtbar werden. Der Allgemeinzustand der mutierten Mäuse gab keinen Hinweis darauf, allerdings liefen sie weniger und zeigten verminderte Muskelkraft. Untersuchungen an isolierten Muskeln zeigten eine signifikant verringerte Kontraktionskraft und eine erhöhte Ausdauer. In Übereinstimmung mit diesen Befunden zeigte sich ein veränderter Muskelaufbau mit vermehrt langsamen Muskelfasertypen. Untersuchungen von Kalziumsignalen und intrazellulären Signalwegen zeigten, dass der erhöhte Kalziumeinstrom während der Kontraktionen jene Signalkaskaden aktivierte, die für die Festlegung der Muskelfaser-Zusammensetzung verantwortlich sind. Somit ist die Umstellung vom leitenden auf den nicht-leitenden Kanal wichtig für die sekundäre Funktion des Kalziumsignals in der Determinierung des Muskelfasertyps. Darüber hinaus führt der chronisch erhöhte Kalziumeinstrom zur Schädigung von Mitochondrien und trägt dadurch zu den Symptomen der Muskeldystrophie bei. Weiters konnten wir mittels biophysikalischer Experimente den molekularen Mechanismus entschlüsseln, der den unterschiedlichen Aktivierungsmechanismen der beiden Kanalvarianten zugrunde liegt. Zuletzt zeigen unsere pharmakologischen Untersuchungen, dass bereits lizensierte Kalziumkanal-Medikamente in Zukunft auch in der Behandlung von Patienten mit Myotoner Dystrophie zum Einsatz gelangen könnten.