Wasser- und Gastransport durch Aquaporine

Dutzenden Veröffentlichungen in hochrangigen Zeitschriften zufolge weisen einige Mitglieder der Aquaporinfamilie eine CO2 Leitfähigkeit auf. Um physiologisch relevant zu sein, müsste der gaskanalfreie Anteil der aquaporinhaltigen Membranen eine gegenüber Modellmembranen gleicher Zusammensetzung 200 bis 1000- fach reduzierte CO2 Leitfähigkeit besitzen. Allerdings ist der molekulare Mechanismus unbekannt, der ein neutrales Molekül, das einen Hexadekan : Wasser Verteilungskoeffizienten von ~ 1 hat, daran hindern könnte, frei durch biologische Membranen zu diffundieren. Wir werden die Hypothese untersuchen, dass Säugetierepthelien aufgrund einer Proteinbarriere (z. B. Uropklakin) oder einer eingeschränkten Carbonanhydraseaktivitiät ein reduziertes PCO2 aufweisen. In Fortsetzung unserer Bemühungen, die Lipidmoleküle zu identifizieren, die die Gasleitfähigkeit Lipiddoppelschichten zu reduzieren im Stande sind, werden wir Archaealipide rekonstituieren und unsere Studie um Transportuntersuchungen von H2S erweitern. Wenn Archaealipide eine Barriere für H2S darstellen würden, wäre die Funktion der Archaea-Aquaporine geklärt. Außerdem planen wir die erste Studie, die zwischen Ammoniak- und Ammoniumleitfähigkeiten pflanzlicher Aquaporine differenzieren kann. Da eine generelle Diskrepanz zwischen Experiment und molekulardynamischen Simulationen dahingehend besteht, ob die Einzelkanalleitfähigkeit pf orthodoxer Aquaporine oder die von Glyceroquaporinen größer ist, werden wir die Wasserflussdichte durch gereinigtes und in ebene Membranen rekonstituieres AqpZ, GlpF und AQP1 erfassen und simultan die Proteindichte mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie erfassen. Sollte sich pf von GlpF als höher erweisen sind die Zweifel an der Anwendbarkeit der Wassermodelle für molekulardynamische Simulationen in eingeschränkten Geometrien unangebracht. Zusätzlich werden wir die aufgrund von Simulationen getroffene Voraussage testen, dass Fluktuationen des in der Aquaporinpore konservierten Arginins durch eine Transmembranspannung beeinflusst werden können, d.h. wir werden den ersten Beweis (oder Gegenbeweis) für ein Schaltverhalten menschlicher Aquaporine erbringen.

Membranen schützen Zellen vor dem unerwünschten Verlust von genetischem Material, Proteinen und Nährstoffen. Damit entsteht im Inneren der Zelle ein individuelles Mikroklima, das diese zur Erfüllung spezifischer Aufgaben in den verschiedenen Geweben und Organen befähigt. Die Membran muss aber auch Nährstoffe in die Zelle hinein und Metabolite heraus- lassen. Beispielsweise müssen H2O und CO2 permanent hin- und hertransportiert werden. Obwohl beide Moleküle durch die Membran diffundieren können, wird häufig von einer Regulation ihres Flusses durch spezialisierte Kanäle, sogenannte Aquaporine ausgegangen. Tatsächlich queren Wassermoleküle die Aquaporine in einer Art Gänsemarsch, d.h. der Kanal ist so schmal, dass die Wassermoleküle einander nicht passieren können. Wenn die Aquaporine wie normale Wasserrohre funktionieren würden, müsste die Reibung mit der Kanalwand zu einer sehr langsamen Strömung führen. Das ist offensichtlich nicht der Fall. Allerdings ist auch nicht klar, wie das mikroskopische Bild tatsächlich aussieht, d.h. wie schnell das Wasser wirklich den Kanal passiert. Um diese Lücke zu schließen haben wir zwei Messansätze für die Erfassung der Einzelkanalleitfähigkeit entwickelt: zum einen direkt in der Zellmembran und zum anderen in Lipidvesikeln, in die der gereinigte Kanal wieder eingebaut wurde. Einzelmolekültechniken haben die Zählung der Kanäle per Membranfläche übernommen, d.h. jeder Kanal wurde mit einem Farbstoff versehen und er wurde außerdem mit einem Atomkraftmikroskop dargestellt, das gleich einem miniaturisiertem Plattenspieler die Höhenunterschiede zwischen Membran und Kanal erfasst. Auf den Wasserfluss selbst haben wir aus der Verdünnung von kleinen Molekülen am Kanalmund bzw. der Volumenabnahme der Lipidvesikel geschlossen. Die Untersuchungen haben gezeigt, dass keinerlei Reibung vorliegt. Im Gegenteil, die Wassermoleküle bewegen sich im Kanal drei bis zehnmal schneller als außerhalb. Die Messansätze bieten die Möglichkeit den Effekt von Pharmaka auf die Einzelkanalleitfähigkeit zu testen und sollten damit von Interesse für die Arzneistoffentwicklung sein.CO2 passiert die Membran relative schnell und kann deshalb kaum durch Aquaporine beschleunigt werden. Wir haben untersucht, ob Uroplakin-Plaques auf der Oberfläche epithelialer Zellen den CO2 Transport verlangsamen können. Obwohl diese den Wasser- und Ammoniakfluss durch Harnblase und -leiter verringern, haben sie keinen Effekt auf den CO2 Transport. Letzterer wird stattdessen durch ein Enzym, die Carboanhydrase reguliert. Diese katalysiert die Umwandlung von Bikarbonat in CO2. Wenn in geringer Menge vorhanden, ist die Reaktion sehr langsam - wie in Sodawasser, aus dem die Kohlensäure nur sehr langsam, d.h. über Stunden, entweicht. Große Mengen des Enzyms sorgen für eine rasche Umwandlung in CO2, dass dann die Zelle ungehindert und ohne Mitwirkung von Aquaporinen verlässt.