Kofaktor- und Substratabhängige Aktivierung des Gerinnungsfaktors IXa

Die Blutgerinnungskaskade ist ein Netzwerk von Serin-Proteasen, Kofaktoren und Inhibitoren. Dieser hoch komplexe Proteinapparat dient dazu, lebensbedrohlichen Blutverlust schnell zu stoppen, wobei allerdings unbeabsichtigte Gerinnselbildung vermieden werden muss. Die Natur meistert diesen Spagat, indem die benötigten Proteasen in einem zymogenen (inaktiven) Zustand vorgehalten werden, so dass diese bei Gefäßverletzungen in einer kontrollierten Kettenreaktion proteolytisch aktiviert werden können. Unter den Gerinnungsfaktoren gilt der Serinprotease Faktor IX und dem assoziierten Kofaktor VIII ein besonderes Interesse, weil Defekte in diesen X- chromosomal kodierten Genprodukten zur Hämophilie führen. Hämophilie betrifft vornehmlich Männer (und Jungen) mit einem Risiko von ca. 1: 5000. Verblüffenderweise zeigt proteolytisch aktivierter Faktor IXa (fIXa) nur in Gegenwart seines Kofaktors VIIIa substantielle proteolytische Aktivität, die zudem ausschließlich auf das physiologische Zielsubstrat Faktor X (fX) gerichtet ist; gegenüber peptidischen Substraten beobachtet man keine Aktivitätssteigerung. Physiologisch läuft die Assemblierung dieses sogenannten Xase-Komplexes sowie die Spaltung des Substrats fX zu fXa auf der Oberfläche von Blutplättchen ab. Die Plättchenmembran unterstützt so zudem Xase-Reaktion, wodurch insgesamt eine etwa millionenfache Reaktionsbeschleunigung resultiert. Die zugrunde liegenden Mechanismen dieser sekundären Aktivierung sind freilich in weiten Teilen unklar und sind der Gegenstand des vorgeschlagenen Forschungsprojektes. Aufbauend auf unseren früheren funktionellen und strukturellen Arbeiten über super-aktive fIXa-Mutanten schlagen wir vor ein vereinfachtes Modellsystem des physiologischen Xase Komplexes zu studieren, der nur die Proteinkomponenten (fVIIIa, fIXa, fX) enthält; der Einfluss der Membran wird bewusst eliminiert. Diesem Ansatz folgend können wir konsequenterweise ein noch stärker vereinfachtes System designen, in dem wir Proteinvarianten konstruieren, bei denen die membran-assoziierten Domänen deletiert werden. Das so resultierende lösliche Xase System zeichnet sich durch eine bisher nicht erreichte chemische und konformationelle Homogenität aus, die die Kristallisation ermöglichen sollte. Im ersten Teilprojekt (A) schlagen wir die Kristallstrukturanalyse eines solchermaßen angepassten fIXa-fVIIIa Komplexes vor. Im Teilprojekt B werden wir dieses lösliche Xase System enzymatisch und thermodynamisch charakterisieren und gegen das klassische Volllängen Xase System vergleichen und kalibrieren. Schließlich werden wir im Teilprojekt C die Mechanismen untersuchen, mit denen Substrate ihre eigene Prozessierung durch die Xase unterstützen. Dazu werden wir mithilfe von Proteom-abgeleiteten Substratbibliotheken die Anforderungen an Substrate abbilden. In einem weiteren Schritt werden wir die beobachteten Substratpräferenzen zur Entwicklung substratartiger (d.h. aktivierender) Inhibitoren verwenden und diese im Komplex mit der Xase kristallisieren. Schließlich werden wir unter Verwendung nicht aktivierbarer Proteinvarianten auch die Kristallisation des ternären fIXa-fVIIIa-fX Komplexes unternehmen.

Bei Gefäßverletzungen droht ein lebensbedrohlicher Blutverlust, der dementsprechend rasch gestoppt werden muss. Gleichzeitig muss allerdings eine unbeabsichtigte Gerinnselbildung und thrombotischer Gefäßverschluss vermieden werden. Um diese delikate Balance von Hämostase (Vermeidung von Blutverlust) und Vermeidung von Thrombosen zu wahren, erfolgen auf eine Gefäßverletzung eine Reihe physiologischer Prozesse, die sich gegenseitig stimulierend aber auch regulierend beeinflussen. Von besonderer Bedeutung ist die hierbei die Aktivierung der sogenannten Blutgerinnungskaskade. Die hierbei beteiligten Proteasen liegen im Blutstrom bereits vor, allerdings in einer inaktiven Form, und aktivieren sich nacheinander. Besonderes Interesse liegt beim Blutgerinnungsfaktor IX (fIX), da es hierbei zusätzlich zur klassischen Aktivierung zum Faktor IXa auch die Stimulierung durch den Kofaktor VIIIa bedarf, um substantielle Aktivität zu gewinnen; bei einem Defekt des Kofaktors VIIIa kommt es daher unweigerlich zum Abdrosseln der Gerinnungsaktivität, was sich klinisch als Hämophilie manifestiert und in etwa einen 10000 Leuten betrifft. Das Ziel des vorliegenden Projektes war daher die Mechanismen der Stimulierung des Faktor IXa durch den Kofaktor und auch dem Substrat Faktor X zu verstehen, weil sich dadurch therapeutische Optionen eröffnen, insbesondere ein kofaktor-unabhängige Stimulierung von Faktor IXa. Aufgrund der Komplexität der Thematik haben wir parallele Handlungsstränge zur Erreichung dieses Ziels beschritten. Zum einen konnten wir durch Mutagenese-Studien Aufschlüsse geben, worin sich die charakteristische aber doch sehr ungewöhnliche enzymatische Latenz des Faktors IXa begründet: Anders als eng verwandte Enzyme gibt es im Faktor IXa ein gekoppeltes Netzwerk enzymatischer Blockaden, die seine proteolytische Aktivität stark drosselt. Wir konnten zeigen, dass diese regulatorischen Blockaden auf mehreren Loop-Bereichen lokalisiert sind.Zum zweiten konnten wir zeigen, wie die Substratspezifität und Affinität von Faktor IX und IXa durch Kofaktor VIII-abgeleitete Peptide beeinflusst werden. Bemerkenswerterweise haben diese fVIII-Peptide auch schon auf die zymogene Faktor IX Form eine signifikante Bindung. Die in den Peptid-Modellen erhaltenen Ergebnisse konnte qualitativ mit Kofaktor VIIIa bestätigt werden.Schließlich konnten wir die A2-Domäne des Kofaktor VIII in einem eukaryotischen Expressionssystem herstellen. Allerdings erwies sich die Produktion als sehr variabel, wobei sich die Parameter nur unzureichend kontrollieren ließen. Dennoch stellen diese Ergebnisse sehr wichtige Ergebnisse für den weitere Bearbeitung rekombinanten Faktor VIIIa dar.