Strukturelle Studien der intraflagellaren Transport komplexe

Zilien und Flagellen sind spezialisierte Organellen, die evolutionär von Protisten bis zu Säugetieren höchst konserviert sind. Sie bestehen aus einem membranumhüllten Axonem und nahezu 700 assoziierten Proteinen. Diese Organellen spielen eine essentielle Rolle in zellulären Signalwegen und wurden kürzlich mit einer Vielzahl von Erkrankungen in Verbindung gebracht. Zilien und Flagellen haben keine Ribosomen oder membrangebundene Vesikel. Sie werden durch einen Prozess, den man IFT (intraflagellar transport) nennt, assembliert und aufrechterhalten. IFT importiert Zilienkomponenten vom Zytoplasma und bringt sie zu ihrer Zielstelle innerhalb des abgeschlossenen Zilienkompartiments. Der IFT wird von 2 Multiproteinkomplexen (IFT-A und IFT-B) vermittelt. Diese Komplexe assoziieren über Motorproteine mit den Mikrotubuli des Axonems und bewegen sich bidirektional an ihnen entlang. Der IFT ist sowohl für den Transport als auch die Entsorgung alter Zilienkomponenten verantwortlich. Obwohl diese drei Proteinkomplexe schon seit einigen Jahren untersucht werden, ist nur wenig über ihre Architektur und ihre Assemblierung bekannt. Das Fehlen von hoch aufgelösten Strukturen dieser Komplexe steht dem molekularen Verständnis des IFT im Wege. Im vorliegenden Antrag planen wir diese Wissenslücke zu schließen. Dazu werden wir eine Kombination von Krystallographie und elektronenmikroskopischen Methoden verwenden. Unsere strukturellen Untersuchungen werden durch strukturbasierte Mutagenese- und in vivo Experimente ergänzt, um unsere mechanistischen Hypothesen zu überprüfen. Die daraus hervorgehenden strukturellen Informationen werden unser Verständnis dieser Proteinkomplexe erweitern und werden uns wichtige Hinweise darauf geben, warum deren Fehlfunktionen zu so einer Vielzahl von Krankheiten führen. Diese Informationen könnten den Weg zum Design von dringend benötigen therapeutischen Substanzen für Millionen von Patienten weltweit weisen.

Das ursprünglich vorgeschlagene Projekt beabsichtigte, die drei-dimensionale Struktur eines Protein Komplexes aufzuklären, der essentiell für den Zusammenbau von eukaryotischen Organellen, sog. Zillien, ist. Zilien sind in allen Zilien Zellen in hohen Maße konserviert und kommen in den meisten eukaryotischen Zellen vor, von Protisten bis zu Säugetier Zellen. Zilien ähneln Antennen, die auf der Zell Oberfläche wachsen und spielen eine wichtige Rolle für die Signalübertragung. Defekte Zilien werden mit einer Vielzahl von Krankheiten in Verbindung gebracht, die Ziliophatien genannt werden. Obwohl Zilien aus hunderten von Proteinen bestehen, sind sie frei von Ribosomen und membran-gebundenen Vesikeln. Eine Zilie wird durch einen Prozess zusammengesetzt und erhalten, der intraflagellarer Transport (IFT) genannt wird, dieser importiert Zilia Komponenten vom Zytoplasma und setzt Sie an ihren Zielort innerhalb des umschließenden Kompartiments der Organelle ab. Der IFT wird von zwei multi-protein Komplexen namens IFT-A und IFT-B ausgeführt, diese sind verbunden mit Motormolekülen, um sich bidirektional entlang der Mikrotubuli des Axonems zu bewegen. Der IFT ist sowohl für den Transport von Zilien Komponenten als auch für die Entfernung überflüssiger Produkte zuständig. Wir haben große Anstrengungen unternommen, um die zwei IFT Komplexe mittels Koexpression ihrer Komponenten in Bakterien und/oder in Insekten Zellen wieder herzustellen, allerdings stellte sich heraus, dass die Komplexe strukturell dynamisch reagierten und wir daher nicht in der Lage waren, vollständig zusammengesetzte Komplexe für strukturelle Studien zu erhalten. Aus diesen Grunde gingen wir später dazu über, eine verwandte zelluläre Struktur, das Zentriol, das für die Verankerung des Ziliums auf der Plasmamembran verantwortlich ist, zu charakterisieren. Neben seiner wichtigen Rolle in der Ziliogenesis ist das Zentriol auch für die Zentrosomen Zusammensetzung verantwortlich. Obwohl Zentriolen seit mehr als hundert Jahren mittels Mikroskop erforscht wurden, ist das Wissen darüber aufgrund der geringen Auflösung beschränkt. Intensive zellbiologische Forschungen auf dem Gebiet der Zentriolen Duplikation in den letzten Jahrzehnten führten zur Identifikation eines Kernsatzes von fünf zentriolaren Proteinen. Dennoch ist für die meisten dieser Proteine keine hoch auflösende Struktur bekannt und der Mechanismus ihres Beitrages zur Zentriolen Formation ist noch unklar. Wir haben untersucht, wie SAS-5 und SAS-6 an der Zentriolen Zusammensetzung aufgrund ihrer Struktur beteiligt sind und weiters, wie ZYG-1, der Hauptregulator der Zentriolen Zusammensetzung, seine Prozentriolen rekrutiert. Am Ende konnten wir die kristalline Struktur der zentralen coil-coiled Domaine von SAS-6 ermitteln, weiters charakterisierten wir die Interaktion mit einen anderen SAS-5, die Oligomerisation und potentielle Funktion von SAS-5 in der zentriolen Zusammensetzung mittels Verwendung verschiedener biophysikalischer Techniken und wir ermittelten die kristalline Struktur der polo-like Kinase ZYG-1 von Nematoden und ihres Homologs Plk4 von der Fruchtfliege. Unsere Arbeit hat uns sehr dabei weitergeholfen, die Zentriolen Duplikation auf dem atomischen Level besser zu verstehen, und ermöglicht uns eine neue wissenschaftliche Basis für zukünftige mechanistische Studien der Kontrolle des Zellzykluses und der Zilia Biogenese auf ihren molekularen Level.