Antiproliferative und antimigratorische Aktivität von I3MO

Abnormale Proliferation und Migration von glatten Gefäßmuskelzellen spielen bei der Entstehung kardiovaskulärer Erkrankungen eine maßgebliche Rolle. Vorausgegangene Arbeiten zeigten, das Indirubin-3-monoxim (I3MO), ein Derivat des roten Indigoisomers, die PDGF (platelet-derived growth factor)-induzierte Proliferation und Migration von glatten Gefäßmuskelzellen potent hemmt. Weiterhin wurden die selektive Hemmung der STAT3 Phosphorylierung in Gefäßmuskelzellen sowie ein verringerte Neointimabildung in einem arteriellen in vivo cuff-Modell in Anwesenheit von I3MO beobachtet. In unserer Arbeit setzen wir an folgenden Hypothesen an: (i) STAT3 Phosphorylierung ist ein essentieller Signaltransduktionsschritt bei der Aktivierung glatter Gefäßmuskelzellen (ii) Die antiproliferative and anti-migratorische Wirkung von I3MO beruht auf der Inhibition von STAT3 Im Laufe des hier beantragten Projektes werden wir den molekularen Wirkmechanismus von Indirubin-3-monoxim (I3MO) genauer untersuchen. Wir werden klären, (i) ob die Hemmung der STAT3 Phosphorylierung durch I3MO kausal mit der Hemmung von Proliferation und Migration von Gefäßmuskelzellen in Verbindung steht. (ii) wie I3MO die Phosphorylierung von STAT3 unterbindet. Dabei werden wir I3MO auf seinen möglichen Einfluss auf Kinasen, Phosphatasen und Redoxsignalling testen. Dazu sind sowohl ein Kandidatenansatz (Src, Abl, Shp2, PTP1B) sowie sytematische Ansätze geplant. Die letzteren umfassen einen kinome array und einen affinitätschromatographischen Ansatz gekoppelt mit MS Analyse, um direkte zelluläre Bindungspartner von I3MO aufzuspüren. (iii) wie I3MO, neben seinen Wirkungen auf VSMC, die Endothelfunktion und entzündliche Prozesse beeinflusst und wieweit dies auf Hemmung von STAT3 zurückzuführen ist. Das Projekt wird neue detailierte Einblicke in die molekulare vasoprotektive Wirkungsweise von I3MO sowie in die Rolle von STAT3 für Wachstum und Migration von glatten Gefäßmuskelzellen geben

Die Hauptbefunde des durchgeführten Projektes lassen sich wie folgt zusammenfassen: (i) Das kleine Molekül Indirubin-3-monoxime (I3MO) zeigt eine dreifach positive Wirkung gegen Gefäßerkrankungen. (ii) Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nrf2 (nuclear factor 2 related 2) und Hemmung der 5-Lipoxygenase sind dabei neu-entdeckte Aktivitäten von I3MO. (iii) 12/15 Lipoxygenase ist ein bislang unbeschriebener, aber essentieller Schalter bei der Aktivierung des Proteins STAT3 (signal transducer and activator of transcription). I3MO, ein wasserlöslicheres Derivat des natürlich vorkommenden Indirubins, wurde auf gefäßschützende Eigenschaften in kultivierten Zellen untersucht. I3MO hemmt Wachstum und Wanderung glatter Gefäßmuskelzellen im niedrigen mikromolaren Konzentrationsbereich. Zudem unterbindet I3MO die Produktion von pro-entzündlichen Mediatoren in primären Monozyten. Somit ist I3MO eine attraktive Verbindung, die zur Verhinderung von Arteriosklerose und Restenose (erneute Gefäßverengung nach Platzierung eines Stents) weiterentwickelt werden könnte. I3MO interferiert mit drei Ursachen, die bei der Entstehung von Arteriosklerose und Restenose eine Rolle spielen: Zellteilung, Zellwanderung und Entzündung. I3MO ist eine Verbindung mit ausgeprägter Polypharmakologie, d.h. sie betrifft nicht nur einen Schalter, sondern beeinflusst mehrere Zielmoleküle in der Zelle, um ihre unterschiedlichen Effekte zu vermitteln. Um die Zellteilung zu stoppen, hemmt I3MO die Aktivierung von STAT3, eines Proteins, das maßgeblich die Synthese von Faktoren steuert, die die Zelle für die Teilung braucht. Um die Wanderung der Gefäßmuskelzellen zu unterbinden, aktiviert I3MO ein Protein mit Namen Nrf2, das dann für die Expression von Proteinen sorgt, die der Zellmigration Einhalt gebieten. Der anti-entzündliche Effekt konnte auf direkte Hemmung der 5-Lipoxygenase zurückgeführt werden, eines Proteins, das Entzündungsfaktoren produziert. Bei der genaueren Untersuchung der STAT3 Hemmung durch I3MO ergab sich, dass die Aktivierung von STAT3 generell stark vom Redoxmilieu der Zelle und im Besonderen von der Aktivität eines Proteins, nämlich der 12/15-Lipoxygenase abhängt. Entsprechend hemmt I3MO die Aktivierung der 12/15-Lipoxygenase in Wachstumsfaktor-stimulierten Gefäßmuskelzellen, senkt so die Level der reaktiven Sauerstoffspezies und hemmt damit STAT3 Aktivierung und Proliferation. In diesem Projekt wurden also neue Bioaktivitäten von I3MO aufgezeigt, die eine mögliche Weiterentwicklung der Verbindung nahelegen sowie bisher unbekannte Zusammenhänge in der Signaltransduktion glatter Gefäßmuskelzellen identifiziert.