Identifikation und Charakterisierung des HRV-C Rezeptors

Unter Verwendung moderner RT/PCR diagnostischer Verfahren, wurde eine Reihe von bisher unbekannten humanen Rhinovirus (HRV) Typen in klinischen Proben identifiziert. Die Sequenzierung ihrer RNA Genome zeigte, dass einige dieser Viren nur weitläufig mit den etablierten HRV Spezies A and B verwandt sind. Diese neuen Isolate wurden als HRV-C klassifiziert. Sie waren bisher nicht gefunden worden, weil sie sich in Zellkultur nicht vermehren. Sie verursachen Symptome ähnlich der Influenza, febrile obstruktive Bronchitis und Asthma und scheinen aggressiver zu sein als die "klassischen" HRVs. Vor kurzem wurde gezeigt, dass zumindest HRV-C102 in primären, aus Nasenschleimhaut gewonnenen Zellen vermehrt werden kann. Wenn das Erfordernis eines Rezeptors umgangen wird (via Transfektion mit viraler genomischer RNA, die in vitro von einem synthetischen cDNA Klon transkribiert wurde) wächst HRV-C102 auch in HeLa Zellen. Dies deutet darauf hin, dass HRV-Cs nicht die ubiquitär exprimierten Rezeptoren, das interzelluläre Adhesionsmolekül 1 und Vertreter der low-density lipoprotein Rezeptor Familie verwenden. Vielmehr erkennen sie höchst wahrscheinlich eine Struktur an der Zellmembran, die nur in wenigen Zellen der Nasenschleimhaut, des inneren Ohres und des unteren respiratorischen Traktes vorhanden ist. Diese Sicht wird durch 3D-Modelle des viralen Kapsids unterstützt: HRV-Cs fehlen die typischen Sequenzmotive und Schleifen, die von den bisher bekannten HRV Rezeptoren erkannt werden. Deshalb ist die Jagd auf diesen unbekannten Rezeptor eröffnet. Wir schlagen vor, den HRV-C Rezeptor (oder die Rezeptoren) zu identifizieren und zu charakterisieren und möglicherweise die 3D-Struktur eines Virus-Rezeptor Komplexes zu lösen um den Mechanismus der gegenseitigen Erkennung auf molekularer Ebene aufzuklären.

Rhinoviren (RV) sind hauptverantwortlich für Infektionen der oberen Atemwege, aber auch häufig an der Verschlechterung schon bestehender Erkrankungen der Lunge beteiligt. Sie werden in drei Spezies A, B und C untergliedert - mit insgesamt über 150 verschiedenen Vertretern. Eine Reihe epidemiologischer Studien hat gezeigt, dass RV-A und RV-C eine stärker ausgeprägte Virulenz als RV-B aufweisen und beispielsweise häufiger bei kindlichem Asthma nachgewiesen wurden. Für eine erfolgreiche Infektion muss sich das Rhinovirus zuerst an einen Rezeptor der Wirtszelle anheften. Danach wird es durch Endozytose ins Zellinnere geschleust wo es zur anschließenden Vermehrung sein genetisches Material (ein Einzelstrang-RNA Genom) aus dem schützenden Kapsid ins Zytosol freisetzt.Um diese frühen Vorgänge der viralen Infektion für die nur schwierig kultivierbaren RV-C besser erforschen zu können war eines unserer Ziele, die zu diesem Zeitpunkt noch unbekannten RV-C Rezeptor(en) zu identifizieren. Dafür haben wir mit erheblichem Aufwand versucht, eine ausreichende Menge an Rhinovirus C15 für den Nachweis und Aufreinigung des Rezeptors zu erhalten. Trotz verschiedenartigster Ansätze konnte dieses Ziel aufgrund des außerordentlich geringen Ertrags an Virus jedoch nicht wie geplant erreicht werden. Im April 2015 haben amerikanische Forscher durch Einsatz von Methoden der Bioinformatik erstmals einen RV-C Rezeptor beschrieben. Aus diesem Grunde haben wir uns daraufhin konzentriert den Infektionsweg zweier Rhinoviren zu charakterisieren, welche zum Anheften denselben Rezeptor (ICAM-1) verwenden, aber den evolutionär unterschiedlichen Spezies A und B angehören. Überaschenderweise wurden diese nach erfolgter Endozytose zu verschiedenen Endosomen transportiert, wo sie dann auch ihr Genom freisetzten. Diese Beobachtung ist im Lichte der beschriebenen divergenten Pathogenizität von RV-A und RV-B von erheblicher Bedeutung. Wir haben des Weiteren einen neuartigen Test entwickelt der es erlaubt, eine experimentell ausgelöste Freisetzung der Einzelstrang-RNA aus dem Kapsid von Rhinoviren quantitativ zu verfolgen. Grundlage dafür ist die Messung der von einer speziellen Sonde (eine Art molekularer Leuchtturm) abgestrahlten Fluoreszenz gepaart mit CHIP Elektrophore. Dieser Test soll zukünftig dazu dienen, den genauen Mechanismus dieses noch wenig verstandenen Vorgangs aufzuklären. In Rahmen des Projektes haben wir zudem die Rolle der bei den meisten Picornaviren am Kapsidprotein VP4 angehefteten Fettsäure untersucht. Es zeigte sich dabei für Rhino-, Coxsackie- und andere Picornaviren, dass nach Hemmung der für diese Myristylierung verantwortlichen Enzyme mittels eines neuartigen Wirkstoffes die Infektiosität neu gebildeter Viren stark abnimmt. Als Ursache haben wir einen ineffizienten Zusammenbau des Virus und zudem ein massives Problem in der Freisetzung der Einzelstrang-RNA von den noch produzierten Viren aufgefunden. Diese Daten sind Grundlage zur Entwicklung einer komplett neuen antiviralen Therapie mit breiter Wirkung gegenüber vielen Picornaviren inklusive Rhinoviren der Spezies A-, B-, und C.