Rolle des DHPR Kalzium Einstroms im Säugerskelettmuskel

Spannungsabhängige Ca2+ Kanäle bewirken einen durch Membrandepolarisation induzierten Ca2+ Einstrom in elektrisch erregbare Zellen wie Neuronen, endokrine Zellen, Sinneszellen und Muskelzellen. Dieser Ca2+ Einstrom initiiert zelluläre Prozesse wie synaptische Transmission, endokrine Sekretion, Transkription und kardiale Muskelkontraktion. Während die kardiale Erregungs-Kontraktionskoppelung (EKK) streng Ca2+ Einstrom abhängig ist, basiert die EKK im Skelettmuskel auf einer Ca2+ Einstrom unabhängigen Interaktion zwischen dem sarkolemmalen spannungsfühlenden L-Typ Ca2+ Kanal oder 1,4-Dihydropyridin Rezeptor (DHPR) und dem sarkoplasmatischen Ca2+-release-Kanal (RyR1). Spannungsinduzierte Konformations-änderungen des DHPRs triggern das Öffnen des RyR1 über eine Protein-Protein Interaktion beider Kanäle, um Ca2+ aus dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) freizugeben, womit die Kontraktion der Myofibrillen bewirkt wird. Während dieses EKK Prozesses kann im Skelettmuskel des Säugers auch ein kleiner und langsam aktivierender Ca2+ Einstrom gefunden werden. Die Rolle dieses Ca2+ Einstroms, der nicht (unmittelbar) für die EKK erforderlich ist, ist immer noch rätselhaft, könnte aber für das Ca2+ Gleichgewicht des Muskels eine entscheidende Bedeutung haben. Experimentelle Ansätze, die Bedeutung dieses Ca2+ Einstroms für die Funktion des Säugermuskels in vivo zu erklären, waren bisher nicht realisierbar, letztlich aufgrund des Fehlens eines geeigneten Tiermodells. Überraschenderweise konnten wir vor kurzem durch patch-clamp-Untersuchungen an frisch dissoziierten Skelettmuskelzellen von Zebrafischlarven entdecken, dass im Zebrafisch (und in allen höheren Teleostei) solch ein DHPR Ca2+ Einstrom fehlt. Die Tatsache, dass Teleostei zwei verschiedene Isoformen der porenbildenden DHPR? 1S Untereinheit exprimieren und dass dies auf verschiedenen Punktmutationen beruht, deutet auf einen evolutionären Druck zur Vermeidung des Ca2+ Einstroms hin. Wir wollen nun systematisch testen, ob in der Physiologie des Ca2+ Managements von Säuger- und Teleostei-Skelettmuskeln prinzipielle Unterschiede bestehen. Unser Ziel ist es, dieses faszinierende Phänomen der Ca2+ Leitfähigkeit / Nichtleitfähigkeit durch den Skelettmuskel DHPR gründlich zu untersuchen. Dabei wollen wir eine Reihe von biophysikalischen und biochemischen Untersuchungen als auch Ganztier-Muskelleistungstests an Tiermodellen (k.i. Maus und transgenem Zebrafisch), die ausgetauschte DHPR Ca2+ Leitfähigkeit besitzen, durchführen. Neben dem evolutionsbiologisch interessanten Aspekt, dass es sich beim Ca2+ Einstrom im Säuger nur um einen evolutionär geduldeten Überrest aus Stadien der frühen Chordatiere handeln könnte (bei denen der DHPR Ca2+ Einstrom das Signal für die RyR- Aktivierung im Skelettmuskel war/ist), besteht aber auch eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass der Ca2+ Einstrom im Skelettmuskel höherer Teleostei ebenso schädlich ist, wie er im Säugermuskel unverzichtbar ist. Von diesen neuen Modellorganismen erwarten wir, einen tieferen Einblick in die Rolle des DHPR Ca2+ Einstrom für das Ca2+ Gleichgewicht der Muskelzelle zu erlangen. Unser Ziel ist es, herauszufinden ob der fehlende Einstrom in Säugetieren zu unausgewogenen intrazellulären Ca2+ Spiegeln führen kann, der die Leistungsfähigkeit der Muskulatur beeinträchtigt und längerfristig massivere physiologische Effekte wie Myotonie oder Lähmung hervorruft. Wenn sich diese Hypothese bewahrheitet, könnten wir in der Lage sein, bisher unerklärte menschliche Myopathien zu identifizieren.

Die Kontraktion des Skelettmuskels wird durch ein depolarisierendes Signal aus dem Nervensystem eingeleitet, das von der Muskelzelle erfühlt wird. Dieser Prozess wird Erregungs-Kontraktion Kopplung (EKK) genannt. Der Spannungsfühler für dieses Erregungs-signal ist der Dihydropyridinrezeptor (DHPR) in der Oberflächenmembran der Muskelzelle. Im Gegensatz zum Ca2+-einstromabhängigen EKK Mechanismus im Herzen, basiert die Skelettmuskel EKK auf einer Ca2+-einstromunabhängigen Protein-Protein Wechselwirkung zwischen dem DHPR und dem Ryanodinrezeptor (RyR1) der SR Membran. Durch diese physische Wechselwirkung wird die spannungsinduzierte Konformationsänderung des DHPRs auf den RyR1 Kanal übertragen, der daraufhin öffnet und große Mengen an Ca2+ aus den SR Speichern frei gibt, das schließlich die Muskelkontraktion induziert.Ein interessantes Phänomen der Skelettmuskulatur EKK ist die Dualität des DHPRs als einerseits Spannungssensor und andererseits Ca2+ Kanal. Während seine einzigartige Rolle als Spannungsfühler für konformationelle EKK fest etabliert ist, wird seine eher klassische Funktion als Ca2+ Kanal schon fast ein halbes Jahrhundert lang kontroversiell diskutiert. Es wurde in Frage gestellt, ob dieser kleine und langsam aktivierende Ca2+ Einstrom während der EKK überhaupt eine Rolle für die Muskelzelle spielen kann, wie z.B. zum Nachfüllen der SR Ca2+ Speicher - oder ob es sich gar nur um ein evolutionäres Relikt aus phylogenetischen Stadien handelt, in denen auch die Skelettmuskel EKK dem herzartigen (Ca2+-einstromabhängigen) Mechanismus folgte? Diese Frage konnte bisher nicht beantwortet werden, da ein entsprechendes Tiermodell fehlte.Im Zebrafisch fanden wir zu unserer Überraschung, dass dieser und auch alle anderen Knochenfischen nichtleitende Ca2+ Kanäle im Skelettmuskel exprimieren. Wenn wir nun an einen sich rasend schnell bewegenden Schwarm von Heringen denken, dann ist es ziemlich offensichtlich, dass dieser Ca2+ Einstrom irrelevant für Knochenfische ist. Aber gilt das auch für den Säugermuskel? Zu diesem Zweck haben wir eine Punktmutation, die für die DHPR Nichtleitfähigkeit (n.c.) im Zebrafischmuskel verantwortlich ist, in das Mausgenom übertragen. In den vielen durchgeführten, standardisierten Leistungstests zeigten sich keinerlei Unterschiede in der Bewegungsaktivität, der motorische Koordination, der Muskelkraft und der Muskel-ermüdbarkeit, wenn junge (3-7 Monate) und auch alte (18-22 Monate) homozygote (n.c.)DHPR Mäuse mit den entsprechenden wild-typ Geschwistern verglichen wurden. In ähnlicher Weise wurden auch keinerlei Unterschiede bei ex-vivo Leistungstests am isolierten EDL (schnell kontrahierender Muskel) und Soleus (langsam kontrahierender Muskel) gefunden und das wieder bei beiden Altersgruppen, was gegen eine mögliche altersbedingte, kumulative Auswirkungen des fehlenden DHPR Ca2+-Einstroms auf die Muskelleistungsfähigkeit spricht. Überraschenderweise ließen quantitative PCR Analysen mehrerer Schlüsselproteine der EKK Maschinerie und des intrazellulären Ca2+ Gleichgewichts keinerlei kompensatorische transkriptionelle Regulation erkennen. All diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese dass der DHPR Ca2+ Einstrom im Säugerskelettmuskel nur ein evolutionäres Relikt ist.