Die Rolle des Tetrahydrobiopterins in der NO-Synthese

Stickstoff-Monoxid (NO) wird durch NO-Synthasen, in zwei aufeinander folgenden Reaktionen aus L-Arginin gebildet. In der O2 und NADPH konsumierenden Reaktion wird intermediär N-Hydroxy-L-Arginin und als Endprodukte L-Citrullin und NO freigesetzt. Die NO-Synthasen sind aus unterschiedlichen Domänen aufgebaut. Die Katalyse findet an einem Cytochrom P450-artigen Häm in der Oxygenase-Domäne statt; die Reduktase- Domäne enthält die Flavine FAD und FMN als Kofaktoren, die Elektronen von NADPH zum Häm transferieren. Die NO-Biosynthese ist streng von der Gegenwart von Tetrahydrobiopterin (BH4) abhängig, das in unmittelbarer Umgebung des Häms bindet. BH4 fungiert als 1-Elektron-Donor in der reduktiven Aktivierung des Oxyferro- Komplexes, der das letzte experimentell nachweisbare Intermediat in dem Reaktionszyklus darstellt. Möglicherweise könnte BH4 auch an der Protonierung des reduzierten Oxy-Komplexes und weiteren Reaktionsschritten beteiligt sein. Trotz großen Fortschritten in der Aufklärung des Mechanismus der NO- Biosynthese sind gerade bezüglich der Rolle von BH4 noch viele Fragen offen, die wir in diesem Projekt genauer untersuchen möchten. (i) Obwohl BH4 den Oxyferro-Komplex (der durch Hämreduktion und darauf folgende Sauerstoffbindung entsteht) reduziert, vermag es nicht, oxidiertes Häm direkt zu reduzieren. Um dieses Phänomen auf den Grund zu gehen, werden wir das Oxidationspotential von NOS-gebundenem BH4 bestimmen. (ii) Bevor die Reaktion der NO-Synthase mit dem Intermediat N-Hydroxy-L-Arginin stattfinden kann, muss zuerst das in der Reaktion mit Arg gebildete BH3 o -Radikal von der Reduktase-Domäne reduziert werden. Insbesondere für die endotheliale NO-Synthase scheint es aber eine Diskrepanz zwischen der Stabilität des BH3 o -Radikals und der relativ langsamen Elektronen-Übertragung vom FMN zum Häm zu geben. Deshalb werden wir den Weg des Elektrons zum BH4 untersuchen und der Frage nachgehen, ob die Geschwindigkeit der Elektronenübertragung zwischen den Domänen für die Regeneration des Pterins ausreicht. (iii) Letztendlich werden wir untersuchen, ob das FMN-Semichinon, das als Elektronendonor für das Häm auf Grund eines zu hohen Oxidationspotentials ausscheidet, unter bestimmten Voraussetzungen als Elektronendonor für den BH4-Kofaktor auftreten kann. Den Großteil dieser Studie werden wir mit Standard- und Rapid-Scan/Stopped-Flow UV/Vis-Spektroskopie durchführen. Zusätzlich werden wir, teilweise in Zusammenarbeit mit anderen Forschungsgruppen, spezielleren Techniken, wie optische Spektroskopie bei niedrigen Temperaturen, Elektron Paramagnetische Resonanz Spektroskopie, Rapid-Freeze und Freeze-Quench Methoden, und Elektrochemie, zum Einsatz bringen. Die Versuche sollen entweder an den Holo-Enzymen und/oder an den isolierten Oxygenase-Domänen der beiden konstitutiven (endothelialen und neuronalen) NO-Synthase Isoformen durchgeführt werden.

Stickstoffmonoxid (NO) ist involviert in einer Reihe von physiologischen Prozessen wie Vasodilatation, Relaxation der glatten Muskelzellen, Neurotransmission und der Immunreaktion. Die Hauptquelle von NO im Körper ist die Umsetzung der Aminosäure L-Arginin in L-Citrullin durch das Enzym NO-Synthase (NOS). Diese Reaktion hängt strikt von der Anwesenheit des Kofaktors Tetrahydrobiopterin (BH4) ab. In Abwesenheit von BH4 ist die NOS nicht im Stande NO zu bilden, reduziert aber Sauerstoff (O2) zu Superoxid (O2) mit möglicherweise verheerenden Konsequenzen. Es ist schon länger bekannt dass die Bindung von BH4 zu der NOS (2 Äquivalente pro Enzymmolekül) nicht von einem einfachen Gleichgewicht beschrieben wird. Wir haben jetzt entdeckt dass anfangs die völlig BH4-freie NOS BH4 tatsächlich in einer einfachen reversiblen Reaktion bindet. Allerdings wird dann, in einer Reaktion die einige Minute zur Vollendung braucht, ein Molekül BH4 quasi-irreversibel gebunden, während die Bindung des zweiten Moleküls sich nicht ändert. Eine wichtige Folge dieses Phänomens ist dass die NOS sich nie ganz auf die Bildung von O2 umstellen wird, aber selbst dann wenn BH4 völlig erschöpft oder oxidiert wird, noch immer O2 und NO gleichzeitig produzieren wird.S-Nitrosothiole werden zunehmend als wichtige eigenständige biologische Signalmoleküle und deshalb als potentielle pharmazeutische Targets betrachtet. Es ist allerdings noch unklar wie diese Verbindungen im Körper gebildet werden. Wir haben jetzt eine neue Reaktion, wobei sehr niedrige Konzentrationen von NO Thiole effizient nitrosieren, ermittelt. Diese Reaktion wird stark von physiologischen Konzentrationen von Magnesium-Kationen stimuliert. Auf Grund kinetischer Studien der Nitrosierung von Glutathion (GSH) und anderen Thiolen durch NO haben wir einen detaillierten Mechanismus dieser Reaktion vorgeschlagen.Zusätzlich zu NO ist in den letzten Jahren Wasserstoffsulfid (H2S) als ein wichtiges kleines Signalmolekül in Erscheinung getreten. Es ist auch klar geworden dass es viele Berührungspunkte zwischen den Signalkaskaden von NO und H2S gibt, wobei man sowohl beiderseitige stimulatorische als auch inhibitorische Effekte gefunden hat. Unsere Studien haben jetzt ergeben dass H2S die Bildung von NO durch die NOS direkt hemmt, freilich nur in ziemlich hoher Konzentration (104 M) und in einer reversiblen Reaktion. Allerdings haben wir auch gefunden dass die benötigte Konzentration in Anwesenheit von NO stark abnimmt (105 M) und dass zudem die Inaktivierung irreversibel wird. Dieses Phänomen wird auch von NO dass von der NOS gebildet wird bewirkt. Diese Reaktion könnte deshalb einen Weg zur protektiven Feedback-Hemmung im Falle pathophysiologisch hoher Konzentrationen von NO/ H2S darstellen.