Strukturen und Mechanismen der Flavivirus Membranfusion

Membranfusion spielt eine wichtige Rolle bei einer Reihe von biologischen Prozessen wie dem intrazellulären Transport und dem Eindringen Lipid-umhüllter Viren in Wirtszellen. Im Fall umhüllter Viren kontrollieren strukturell unterschiedliche Klassen von viralen Oberflächenproteinen (Fusionsproteine) diesen Prozess. Ausgelöst durch einen spezifischen "Trigger" kommt es in diesen Proteinen zu Konformationsänderungen, die zur Membranfusion führen: Zunächst wird ein hydrophobes Sequenzelement (Fusionspeptid) exponiert, das an die Zielmembran bindet. Anschließend lagert sich das Protein in eine Haarnadel-ähnliche Struktur um, in der das Fusionspeptid und der Membrananker auf derselben Seite des Moleküls liegen. Durch diese Strukturänderungen werden die beiden zu verschmelzenden Membranen in räumliche Nähe gebracht, "Lipid mixing" findet statt und schließlich öffnet sich eine Fusionspore, durch die das virale Genom in die Zelle gelangt. Im Rahmen dieses Projektantrags werden - bisher noch nicht adressierte - Aspekte des Fusionsprozesses von Flaviviren untersucht. Flaviviren umfassen wichtige humanpathogene Viren wie z.B. das Gelbfieber Virus, die Dengue Viren, das West Nil Virus, das Japanische Enzephalitis Virus und das Frühsommermeningoenzephalitis (FSME) Virus. Flaviviren dringen über Rezeptor-vermittelte Endozytose in die Zelle ein, und die Fusion wird durch den sauren pH in den Endosomen ausgelöst. Die atomaren Strukturen löslicher Formen des Fusionsproteins E ("envelope protein E") von Dengue, West Nil und FSME Viren wurden mittels Röntgenbeugungsanalyse bestimmt, aber wichtige Elemente (die sogenannte Stamm- und die Membrananker-Regionen), die vermutlich für die Vollendung der Fusion essentiell sind, sind in diesen Strukturen nicht enthalten. Das Ziel dieses Projekts ist es, die Endphasen der Flavivirus Membranfusion näher zu definieren. Zu diesem Zweck werden wir versuchen - in einer Kooperation mit Spezialisten des Pasteur-Instituts in Paris - die Struktur des E Proteins mit der Stamm-Region in seiner Post-Fusionskonformation aufzuklären. Unter Verwendung von spezifischer Mutagenese in Kombination mit biochemischen und funktionellen Analysen werden wir die Rolle der Stamm-Region und des Fusionspeptids in diesen späten Stadien untersuchen. Die Aufklärung struktureller und mechanistischer Details - wie sie in dieser Studie vorgeschlagen werden - sollten neue Erkenntnisse über die komplexe Regulation des Eindringens von Flaviviren in die Wirtszelle liefern. Wie für das humane Immundefizienz Virus (HIV) gezeigt wurde, können solche Einsichten auch als Anhaltspunkt für die Identifizierung und Entwicklung spezifischer antiviraler Agentien dienen.

Im Rahmen dieses Projekts wurden molekulare Mechanismen untersucht, die es Flaviviren, insbesondere dem Frühsommermeningoenzephalitis (FSME) Virus, erlauben Wirtszellen zu infizieren. Das FSME Virus wird durch Zecken übertragen und verursacht > 10,000 Erkrankungsfälle pro Jahr in weiten Teilen Europas und Asiens. Es ist ein naher Verwandter einer Reihe von bedeutenden und weltweit verbreiteten Infektionserregern, die durch Stechmücken übertragen werden, wie z.B. Dengue, Gelbfieber, Zika, West Nil und Japanische Enzephalitis Viren. Derzeit gibt es keine spezifischen Medikamente zur Behandlung von Flavivirus Infektionen. Ein molekulares Verständnis der virusspezifischen Prozesse in infizierten Zellen ermöglicht die Identifizierung von Angriffspunkten für potentielle antivirale Agentien und stellt somit die Voraussetzung für deren Entwicklung dar. Unsere Studien konzentrierten sich auf die Erforschung des Viruseintritts, i.e. die Bindung des Virus an die Wirtszelle und des Fusionsprozesses, bei dem die Viren ihre Membran mit einer zellulären Membran verschmelzen und dadurch die Infektion der Wirtszelle ermöglichen. Sowohl die Bindung an die Zelle als auch die Fusion werden durch ein Protein an der Oberfläche des Virus vermittelt (Fusionsprotein), das seine fusionsaktive Form erst nach Wechselwirkungen mit bestimmten zellulären Faktoren einnehmen kann. In diesem Projekt etablierten wir experimentelle Ansätze, mit denen die verschiedenen Etappen des Eindringens in die Zelle untersucht werden konnten. Dadurch waren wir in der Lage strukturell wichtige Regionen des Fusionsproteins zu identifizieren und deren Rolle beim Viruseintritt näher zu charakterisieren. Das Beispiel des Humanen Immundefizienz Virus (HIV) zeigt, dass eine genaue Kenntnis der am Viruseintritt beteiligten Strukturen gute Angriffspunkte für antiviral wirksame Substanzen bietet. Die in unseren Studien erzielten Ergebnisse leisten somit einen substantiellen Beitrag für das molekulare Verständnis des Eindringens von Flaviviren in die Wirtszelle und können die Entwicklung von antiviralen Medikamenten erleichtern, die gezielt an diesen Schritten des viralen Lebenszyklus angreifen.