Funktion von Sm Proteinen in Sulfolobus solfataricus

Sm und Sm-ähnliche Proteine sind in allen drei Domänen des Lebens hoch konserviert und sind in allen Organismen an verschiedenen Aspekten des RNA Stoffwechsels beteiligt. Das E. coli Sm-ähnliche Protein Hfq ist an der post-transkriptionalen Regulation beteiligt. Eine wesentliche Aufgabe des Hfq ist die sogenannte Riboregulation, die über kleine nicht-kodierende RNAs (ncRNAs) vermittelt wird. In der Riboregulation führt die Bindung der ncRNAs an mRNAs entweder zu einer Aktivierung oder einer Inhibierung der Genexpression. In Eukaryoten ist der Lsm2-8 Komplex im Nukleus lokalisiert, wo er an der RNA Prozessierung und dem Abbau von nukleolären RNAs beteiligt ist. Der Lsm1-7 Komplex ist in cytoplasmatischen `processing bodies` (P-bodies) lokalisiert, bindet an deadenylierte mRNAs und begünstigt das Entfernen der 5` Cap Struktur, welches dem 5-> 3 gerichtetn mRNA Abbau vorangeht. Trotz der Verfügbarkeit mehrerer 3D- Strukturen von archaellen Sm Proteinen ist ihre Funktion noch wenig erforscht. Diese Studie hat zwei Ziele: Sie zielt erstens darauf ab, eine Rolle für die Sm-Proteine zu definieren, und zweitens einen molekularen Mechanismus, der einer ncRNA-vermittelten Genregulation zugrunde liegt in dem crenarchaellen Modellorganismus Sulfolobus solfataricus (Sso) aufzuklären. Ein Teil dieser Studie baut auf zwei, im Vorfeld identifizierten Sso ncRNAs und ihren vorhergesagten Ziel- mRNAs, auf. Unsere vorläufigen Daten bestätigten die Expression dieser ncRNAs und indizieren, das diese einen Duplex mit dem 3` nicht translatierten Ende ihrer mutmaßlichen Ziel-mRNA ausbilden können, ein Mechanismus der an die Aktivität eukaryotischer miRNAs erinnert. Mit Hilfe genetischer und biochemischer Studien soll versucht werden, eine Rolle dieser beiden ncRNAs in der post-transkriptionalen Regulation aufzuzeigen, d.h. ob diese ncRNAs die Effizienz der Translation und/oder die Stabilität der Transkripte beeinflussen. Darüber hinaus soll ermittelt werden, ob die Sso Sm Proteine an diesem(n) Prozess(en) beteiligt sind. Im zweiten Teil soll versucht werden zunächst Sm1 und Sm2 Deletions-Stämme herzustellen und anschließend eine mögliche Änderung im Genexpressionsmuster mit einer Transkritpomanalyse aufzuzeigen. Weiters sollen ncRNAs und/oder mRNAs, die mit Sso Sm1 und Sm2 Proteinen interagieren mit Hilfe der `Deep Sequencing` Analyse identifiziert werden. Die kombinatorische Analyse der `Microarray`- und Sequenzierdaten sollte es ermöglichen eine fundierte Vermutung über ncRNAs und ihre Ziel-mRNA anzustellen. Einige der ncRNA/mRNA Kandidaten, die in dem "Screen" vorraussichtlich identifiziert werden, sollen dann ausgewählt und der/die zugrunde liegende(n) regulatorische(n) Mechanismus(en) untersucht werden. Zusätzlich sollen mögliche Proteine identifiziert werden, die an der Riboregulation in Sso beteiligt sind. Mögliche Kandidatenproteine sollen weiters im Hinblick auf ihre direkte oder indirekte Interaktion mit Sm Proteinen untersucht werden. Es wird erwartet, dass diese Studie dazu beiträgt, ein besseres Verständnis der post-transkriptionalen Regulation in Archaea zu gewinnen und dass diese Studie Aufschlüsse über die ncRNA-vermittelte Regulation im Bezug auf die Evolution dieses Prozesses gibt.

Sm und Sm-ähnliche Proteine sind in allen drei Domänen des Lebens hoch konserviert und in allen Organismen an verschiedenen Aspekten des RNA Stoffwechsels beteiligt. Trotz der Verfügbarkeit mehrerer 3D-Strukturen von archaeellen Sm Proteinen ist ihre Funktion wenig erforscht. Diese Studie zielte darauf ab eine Rolle für die Sm-Proteine in dem crenarchaeellen Modellorganismus Sulfolobus solfataricus (Sso) zu definieren. Weiters sollte untersucht werden, ob nicht-kodierende (nc) RNAs an der post-transkriptionalen Regulation in Sso beteiligt sind.Wir konnten erstmals nachweisen, dass eine Regulation über antisense RNA in einem hyperthermophilen Archaeon stattfindet. Die von Transposons stammenden paralogen RNAs, RNA-2571-4, sind zum nicht-translatierten 3 Ende der Sso 1183 mRNA komplementär. Diese mRNA kodiert für einen möglich Phosphatransporter. Phosphatlimitierung korrelierte mit einer Abnahme der RNA-2571 und einer Zunahme der1183 mRNA Konzentrationen. Die 1183 mRNA wurde in vitro schneller in Lysaten bei Anwesenheit der RNA-2571 degradiert. Die Insertion des 3 Endes der 1183 mRNA nach dem lacS Gen führte zu einer Reduzierung der lacS mRNA Konzentration. Diese Studien weisen darauf hin, dass die antisense Regulation in trans funktioniert.Es wurden kurze RNA Motive identifiziert, die spezifisch an das Sso Sm2 protein binden (Sm2 RNA Motiv). Nach Aufklärung der Röntgenstruktur des Sm2 Proteins wurden Aminosäuren in dem Protein identifiziert mit denen das Sm2 RNA Bindemotiv interagiert. Weiters konnten wir zeigen, dass die Präsenz des Sm2 RNA Motiv die Stabilität einer mRNA beeinflussen kann.Ein weiterer Aspekt der Studien beinhaltete die Identifizierung von Proteinbindungspartner von Sso Sm1 und Sm2. Unter anderen wurden Komponenten des RNA Exosoms gefunden. In weiteren Experimenten konnte eine direkte Interaktion von Sm1 und Sm2 mit der DnaG Untereinheit des Exosoms nachgewiesen werden. Darüberhinaus konnte in vitro gezeigt werden, dass die Sm1 und Sm2 Proteine die 3-5 Exonucleaseaktivität des Exosomes inhibieren.Es wurden mehrere nicht-kodierende RNA Kandidaten identifiziert, die an Sm1 und/oder Sm2 gebunden waren. Deletionsmutanten wurden für 2 nicht kodierende RNA Gene konstruiert. In einem Fall wurde das Wachstum beeinträchtigt, während die andere Deletionsmutation zu einem besseren Wachstum führte. Gegenwärtig werden Transktiptomstudien durchgeführt, um die Zielgene letzterer ncRNA zu eruieren.Wir konnten kürzlich eine Deletionsmutante in dem Sm1 Gen herstellen. Gegenwärtig werden Transkriptomstudien durchgeführt, um den Einfluss von Sm1 auf die gesamt RNA Stabilität zu untersuchen.