Persistenz bakterieller DNA in Böden

In den letzten Jahrzehnten konnten eine Reihe von molekularbiologischen Methoden etabliert werden, die eine kultivierungsunabhängige Untersuchung der Mikroflora erlauben. Speziell verschiedene Fingerprint-Methoden (DGGE etc.) wurden und werden in großem Umfang dazu verwendet, mikrobielle Populationen zu charakterisieren und zu untersuchen. Die Grundlage all dieser Methoden ist eine erfolgreiche, vollständige aber auch nicht falsch- positive Nukleinsäureextraktion, welche sich allerdings in komplexen Matrizes wie Schlämmen oder Böden als nicht unproblematisch erwiesen hat. Speziell die Unterscheidung zwischen toten und lebenden Zellen wurde in jüngster Zeit von verschiedenen KollegInnen als nicht gelöstes Problem erkannt - eine Einschätzung, die wir durch eigene Untersuchungen bestätigen konnten. Selektive Extraktionsverfahren mit EMA und PMA, wie sie daher jüngst entwickelt und auch an unserem Institut angewandt wurden, haben zwar zur Verbesserung, wenn auch nicht zur vollständigen Lösung des Problems beigetragen. Sie werfen z.T. sogar neue Probleme auf. Nach wie vor kann bei der Nukleinsäureextraktion nicht ausgeschlossen werden, dass durch zuviel extrahierte Nukleinsäuren Organismen detektiert werden, die gar nicht mehr leben oder aktiv sind und daher zumeist irrelevant sein dürften. Über den wahrscheinlichen Anteil einer solchen Fehlextraktion ist nur wenig bekannt. Im beantragten Projekt wird daher untersucht, ob zwischen der Lebensfähigkeit von Organismen einerseits und der Extrahierbarkeit der entsprechenden DNA andererseits eine Diskrepanz besteht, wie groß diese ist und wovon deren Ausmaß abhängt. Stellvertretend für andere komplexe Matrizes wird Boden verwendet, da dieser ein ökologisch relevantes Substrat darstellt und die darin vorkommenden Tone und Huminstoffe die Gefahr von falsch positiven Resultaten erfahrungsgemäß erhöhen. Um die Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit der Untersuchung zu gewährleisten, wird ein kommerziell erhältlicher landwirtschaftlicher Standardboden verwendet. Inhaltlich gliedern sich die geplanten Untersuchungen in drei Bereiche: Es werden die Extrahierbarkeit der gesamten und freien DNA in Böden, die Stabilität der DNA im Zeitverlauf und der Einfluss von basalen Bodenparametern (pH, OS, Tone) auf die Stabilität der Nukleinsäure untersucht. Neben der Untersuchung gesamter Nukleinsäuremengen werden an Hand von spezieller, dem Boden zugesetzter Nukleinsäure die Extrahier- und Quantifizierbarkeit der entsprechenden DNA mit Hilfe von RT-PCR untersucht. Ein Vergleich der Ergebnisse dieser molekularbiologischen Ansätze mit konventionell kulturtechnisch erhobenen Daten wird eine Unterscheidung zwischen toten und lebenden Zellen und den Nachweis von falsch positiven Resultaten ermöglichen. Es ist zwar nicht das primäre Ziel des gegenständlichen Projektes eine neue/verbesserte Methode zur DNA-Extraktion zu entwickeln, doch ist die Kenntnis über das Ausmaß und mögliche Ursachen von Fehlern bei der Extraktion die Voraussetzung dafür. Sollten sich bewahrheiten, und vieles deutet darauf hin, dass übliche DNA-Extraktionsverfahren leicht zu falsch positiven Resultaten führen, werden manche Ergebnisse entsprechender Untersuchungen in neuem Licht zu sehen sein.

Molekularbiologische Methoden stellen mittlerweile eine unverzichtbare Grundlage dar, die eine kultivierungsunabhängige Untersuchung der Mikroflora verschiedener Habitate erlauben. Speziell verschiedene Fingerprint-Methoden (DGGE etc.), aber auch höchst moderne Sequenzier-Techniken wurden und werden in großem Umfang dazu verwendet, mikrobielle Populationen zu charakterisieren und zu untersuchen. Die Grundlage all dieser Methoden stellt eine erfolgreiche, vollständige aber auch nicht falsch-positive Nukleinsäure-Extraktion dar, welche sich allerdings in komplexen Matrizes wie Böden als nicht unproblematisch erwiesen hat. Speziell die Unterscheidung zwischen toten und lebenden Zellen stellt den Anwender oftmals vor große Probleme. Im vorliegenden Projekt wurden die Auswirkungen verschiedener Methoden und Protokolle zur Extraktion von DNA aus Standard-Boden untersucht. Dabei wurden auch die Auswirkungen diverser Desintegrationsstrategien auf die gesamt-extrahierbare DNA Menge und die DNA Fingerprints überprüft. Weiters wurde eine Methode zur selektiven Abtrennung von DNA aus nicht lebenden Zellen getestet und aufwändig optimiert, doch konnte keine umfassende und reproduzierbare Wirkung erzielt werden. Dennoch konnten eindeutig Schwächen und Fehler verschiedener Standard-Extraktionsverfahren aufgezeigt werden. Die Variation verschiedener abiotischer Bodenparameter zeigte deren Einfluss auf die gesamt extrahierbare DNA Menge, aber auch auf deren Qualität.