Protein C Inhibitor und JFC1/Synaptotagmin-like protein 1

Protein C Inhibitor (PCI) ist ein sezernierter Proteaseinhibitor aus der Serpin (Serinprotease Inhibitor)-Familie. PCI inaktiviert ein breites Spektrum an Proteasen und kommt beim Menschen in fast allen Körperflüssigkeiten vor. Eine besondere Rolle dürfte PCI im männlichen Reproduktionstrakt spielen, da männliche, homozygote PCI- knockout Mäuse infertil sind. PCI gehört zur Gruppe der Heparin-bindenden Serpine, und Heparin kann seine Aktivität und Wirkspezifität modulieren. Vor kurzem konnten wir zeigen, dass PCI auch anionische bzw. oxidierte Phospholipide bindet, die ebenfalls die Aktivität von PCI regulieren können. Weiters konnten wir zeigen, dass PCI über einen unkonventionellen Mechanismus unter Beteiligung des Phospholipids Phosphatidyläthanolamin von Zellen internalisiert und in den Zellkern transloziert werden kann. Unter Zuhilfenahme verschiedener methodische Ansätze ist es uns gelungen, eine Reihe von intrazellulären Proteinen zu identifizieren, die mit PCI interagieren könnten. Die Interaktion von PCI mit einem dieser Proteine, nämlich JFC1 (synaptotagmin-like protein 1), wurde genauer untersucht. JFC1 wurde ursprünglich als Reaktionspartner eines Proteins aus dem NADPH-Oxidase Komplex, nämlich p67phox, entdeckt. JFC1 bindet an Phospholipide und gehört zu den Effektormolekülen der kleinen GTPase Rab27a, welche an diversen vesikulären Transportprozessen der Zelle beteiligt ist. Wir konnten zeigen, dass endogener PCI und endogenes JFC1 intrazellulär co-lokalisiert sind und aus Zellextrakten co- immunpräzipitiert werden können. Diese Befunde sprechen für eine direkte Bindung von JFC1 an PCI. Bisher konnten wir diese Bindung im reinen Sytem jedoch noch nicht nachweisen. Deshalb ist es auch unklar, welche Moleküldomänen and der Bindung beteiligt sind und inwieweit andere Faktoren diese Bindung beeinflussen. Völlig unklar ist außerdem die biologische Bedeutung einer Bindung von PCI an JFC1. Es ist daher Ziel des vorliegenden Projektes, einerseits die Bindung von PCI an JFC1 biochemisch zu analysieren. Insbesondere soll festgestellt werden, welche Moleküldomänen jeweils an der Bindung beteiligt sind und welche andere Faktoren (Proteine, Phospholipide) diese Bindung beeinflussen. Weiters soll die biologische Bedeutung der Bindung von PCI an JFC1 untersucht werden. Dies soll einerseits auf molekularer Ebene geschehen, indem bekannte Funktionen der Proteine in Gegenwart und Abwesenheit des Reaktionspartners untersucht werden. Da das Rab27/JFC1 System für intrazelluläre Transportprozesse und geregelte Sekretion wichtig ist, soll auch untersucht werden, ob JFC1 für die Sekretion von PCI oder für dessen Internalisierung und Translokation in den Kern notwendig ist.

Die Ergebnisse dieses Projektes tragen dazu bei zu verstehen, welche molekularen Eigenschaften ein extrazelluläres Protein dazu befähigen, die Phospholipidschicht der Zellmembran zu durchdringen und in den Zellkern zu gelangen. Weiters zeigen wir, wie dieses Protein die intrazelluläre Lokalisation eines anderen Proteins beeinflussen kann. Wir untersuchten die Wechselwirkung zwischen dem intrazellulären Protein JFC1 (Synaptotagmin-like protein1) und einem sezernierten, extrazellulären Protein (Protein C Inhibitor, PCI, SerpinA5), welches über einen unkonventionellen Mechanismus von Zellen aufgenommen und in den Zellkern transferiert werden kann. Wir identifizierten jene Molekülabschnitte, die für das Durchdringen der zellulären Phospholipid-Membran durch PCI und für seine Translokation in den Zellkern verantwortlich sind. PCI ist ein Serinproteaseinhibitor (Serpin), der viele Proteasen hemmt, im humanen System in sehr vielen Geweben synthetisiert wird und in den meisten Körperflüssigkeiten und Sekreten vorkommt. Im Maus-Modell ist das Vorhandensein von PCI Voraussetzung für männliche Fertilität. Beim Menschen scheint dieses Protein auch hemmende Wirkung auf Tumorwachstum und Metastasierung zu haben. Wir konnten in diesem Projekt zeigen, dass ein bestimmter Abschnitt des PCI-Moleküls vorhanden sein muss, damit das Protein von Zellen internalisiert werden kann. Dieser Molekülabschnitt kann durch ein zellmembranständiges Enzym abgespalten werden, was eine Möglichkeit der Steuerung der PCI-Internalisierung darstellt. Wir konnten weiters den Molekülabschnitt identifizieren, der für die Translokation von PCI in den Zellkern verantwortlich ist. In einem früheren Projekt konnten wir bereits mittels eines molekularbiologischen Screeningverfahrens zeigen, dass PCI sehr wahrscheinlich JFC1 bindet. JFC1 ist ein Protein, das an bestimmte Phospholipide der Zellmembraninnenseite bindet und wahrscheinlich für die Sekretion bestimmter Proteine notwendig ist. Diese JFC1-bindenden Phospholipide binden in vitro auch PCI. JFC1 kann durch AKT/Proteinkinase B phosphoryliert werden und wird dann von der Zellmembran ins Zytosol freigesetzt. Wir konnten zeigen, dass in verschiedenen Zellen/Zelllinien PCI und JFC1 tatsächlich interagieren. In Prostata Zellen bewirkt PCI, dass JFC1 von der Zellmembran in den Zellkern transloziert wird. Wir konnten auch zeigen, dass sowohl überexprimierter als auch von außen zugesetzter PCI zu AKT/proteinkinase B-Aktivierung führt und dass diese AKT-Aktivierung Voraussetzung für die Translokation von JFC1 in den Zellkern ist.