Atomare Mutagenese der kleinen ribosomalen Untereinheit

Die kleine Untereinheit des Ribosomes ist ein unverzichtbares Element der Proteinsynthese. Sie ist verantwortlich für die Bindung der messenger RNA und dessen Dekodierung, um eine schnelle und präzise Proteinsynthese zu ermöglichen. Des Weiteren sind strukturelle Änderungen in der kleinen Untereinheit nötig um die Translation zu ermöglichen. Unser Ziel ist es verschiedene Aspekte der Translation der 30S Untereinheit mittels atomarer Mutagenese zu untersuchen. Die Grundlage dafür stellt eine auf in vitro Rekonstitution basierende Methode dar. Für diesen Ansatz verwenden wir fragmentierte 16S rRNA, der ein bestimmter Teil des Moleküls fehlt. Dieses fehlende RNA Stück wird im Zuge der Rekonstitution wieder mit chemisch synthetisierter RNA aufgefüllt, welche die erwünschte nicht natürliche Modifikation enthält. Auf diese Weise sind wir in der Lage chemische Gruppen gezielt zu verändern, um strukturelle und chemische Eigenschaften präzise zu modulieren. Abhängig von der Fragestellung kann mittels dieser Strategie fast jede erdenkliche Region der 16S rRNA untersucht werden. Einen Aspekt der Translation, den wir im Zuge dieses Projekts untersuchen werden, ist die Dekodierung der mRNA. Die Basis für eine funktionierende Proteinsynthese ist die richtige Übersetzung der mRNA. Das Ribosom übernimmt darin eine Schlüsselstelle, indem sie die richtige Codon:Anticodon Brücke gewährleistet. Involviert darin sind die Nukleotide G530, A1492 und A1493 der 16S rRNA. Indem wir jedes Nukleotide Position um Position verändern können, können wir ein detailiertes Bild erstellen welche funtionellen Gruppen sich wie stark an diesem Prozess beteiligen und inwiefern sich diese Modifikationen auf die Präzision der Proteinsynthese durch das Ribosomes auswirken. Ein weiterer Aspekt den wir untersuchen werden ist die Translokation der Anticodons der tRNAs in der kleinen Untereinheit. Aufgrund struktureller Daten wurde ein sterischer Block zwischen der P-Stelle und E-Stelle postuliert, der die Translokation der Anticodon-Teils der tRNA blockiert. Erst nach strukturellen Änderungen in dieser Region ist die vollständige Translokation möglich. Dieses sterische Hindernis ist bedingt durch die Nukleotide A790 und G1338 bis U1341. Ob und wie diese Nukleotide die tRNA auf ihren Weg blockieren ist eine Frage die wir mittels der in vitro Rekonstitution beantworten wollen.

Die Proteinbiosynthese ist ein zentraler Prozess in jeder Zelle eines jeden Organismus. Ein exaktes Zusammenspiel von mehr als 80 Proteinen, verschiedenen RNAs und Molekülen wie GTP oder ATP sind notwendig, um Proteine schnell und effizient anhand des Bauplans in Form von mRNAs zu synthetisieren. Das Ribosom, ein Komplex bestehend aus drei ribosomalen RNAs und mehr als 50 Proteinen, ist das zentrale Element dieses Prozesses. Das Ribosom ist verantwortlich, die mRNA zu binden und möglichst genau und effizient in eine Abfolge von Aminosäuren zu übersetzen. Ein entscheidender Schritt ist das binden der korrekten tRNA in die A-Stelle des Ribosoms. In dieser A-Stelle wird die Interaktion zwischen dem Kodon der mRNA und dem Antikodon der tRNA durch das Ribosom auf ihre Richtigkeit überprüft. Nachdem die ersten hochauflösenden Kristallstrukturen von Ribosomen und ihren Untereinheiten publiziert worden waren, wurde ein Modell postuliert wie das Decoding auf atomarer Ebene funktionieren könnte. Nukleotide der 16S rRNA bilden mit der tRNA und der mRNA Wasserstoffbrücken aus und können so die Geometrie der Interaktion auf ihre Richtigkeit überprüfen.Ziel dieses Projektes war es diese Hypothese, die fast ausschließlich auf Strukturdaten beruht, biochemisch zu überprüfen. Hierzu wollten wir einzelne Wasserstoffbrücken, die zwischen rRNA, mRNA und tRNA ausgebildet werden, eliminieren und die Auswirkung auf die Translation und im Speziellen auf das Decoding untersuchen.Mittels einer in vitro Rekonstitution der 30S Untereinheit konnten wir gezielt funktionelle Gruppen oder Atome der Nukleotide A1492 und A1493 verändern. Diese modifizierten Ribosomen wurden dann in unterschiedlichen Versuchsanordnungen auf ihre Translationeffizienz und Translationsgenauigkeit überprüft. Zu unserer Überraschung konnten einige Wasserstoffbrücken eliminiert werden, ohne das Decoding wesentlich zu verändern. In Übereinstimmung mit kürzlich veröffentlichten Daten, sind demnach nicht die Wasserstoffbrücken zwischen mRNA, tRNA und rRNA entscheidend für das Decoding, sondern die Geometrie der Kodon/Antikodon Interaktion.