NMR Studien am Relaxosom

Bakterielle Konjugation ist der gerichtete Transfer von einzelsträngiger DNS eines konjugativen Plasmids oder chromosomalen konjugativen Elementen von einer Donor zu einer Empfänger Zelle durch direkten Zell-Zell Kontakt. Diese Art des horizontalen Gentransfers wird typischerweise von Bakterien benutzt um genetische Information auszutauschen und ist ein fundamentaler Mechanismus der Evolution von Bakterien, Archaea und einzelligen Eukaryoten. Der konjugative DNS Transfer ist zum Beispiel der Hauptmechanismus zur Verbreitung von Antibiotikaresistenzgenen. Die Proteine welche im Nukleinsäurentransfer involviert sind befinden sich am Donorplasmid. Die meisten davon sind kodiert in der tra (Transfer) Region. Darunter befinden sich Proteine welche das Relaxosom formen; - ein aus mehreren Komponenten bestehender Nukleoproteinkomplex welcher die DNS für den Transfer vorbereitet. Dabei wird die DNS durch die Relaxase Domäne des Proteins TraI geschnitten und dann entwunden durch die TraI Helicase Domäne. Anschließend wird die DNS durch das Protein TraD welches eine Pore in der inneren Membran bildet transportiert. Die Bindung von DNS an TraI wird unterstützt durch die Hilfsproteine TraY, TraM und IHF. Das Relaxosom wechselwirkt mit dem Membranprotein TraD mittels TraM. Direkte Wechselwirkungen der Hilfsproteine mit DNS erhöhen nicht nur die Spezifität sondern auch die Effizienz der Relaxase und unterstützen auch das lokale Aufschmelzen von doppelsträngiger DNS. Wie die Hilfsproteine die Spezifität der DNS Bindung beeinflussen ist derzeit so gut wie unbekannt. Im Zuge dieses Projektes werden wir die Struktur des Hilfsproteins TraY untersuchen. Um die biologische Funktion zu verstehen ist es auch notwendig zu wissen wie dieses Protein mit DNS interagiert. Deswegen werden wir auch die Struktur oder Art der Wechselwirkung von TraY mit DNS untersuchen. Zusätzlich untersuchen wir strukturelle Änderungen in der C- terminalen Tetramerisierungs-Domäne von TraM als Funktion des pH Wertes um zu sehen wie solche Änderungen die Bindung an TraD beeinflussen. Durch die Entschlüsselung der pH-abhängigen Bindung könnte auch das bisher unbekannte "Paarungssignal" welches die bakterielle Konjugation startet gefunden werden. In den strukturellen Studien werden wir Relaxationserhöhungen in einer paramagnetischen Umgebung (PREs) benutzen um Entfernungen der Kerne von der Proteinoberfläche zu erhalten. Diese PREs werden zusammen mit herkömmlichen strukturrelevanten Parametern in einem alternativen Strukturbestimmungsalgorithmus eingesetzt werden welcher im Zuge dieses Projektes weiterentwickelt wird.

Bakterielle Konjugation ist der gerichtete Transfer von DNA zwischen Bakterien durch Zell-Zell Kontakt. Sie stellt einen Hauptmechanismus der bakteriellen Evolution dar und ist maßgeblich beteiligt an der Verbreitung von Antibiotikaresistenzen. Bei diesem Prozess dockt das Relaxosom (ein Protein-Nukleinsäuren Komplex) an das Kopplungsprotein TraD, welches dann die DNA oder den DNA-Protein Komplex durch die Membran von Gram negativen Bakterien transferiert. Im Zuge dieses Projektes fanden wir heraus dass die bakterielle Konjugation in der F Plasmid Familie, und im speziellen das Andocken des Relaxosomes an die Transfermaschinerie durch eine großteils unstrukturierte Domäne im C-terminus des hexameren Kopplungsproteins TraD reguliert wird. Diese regulative Domäne von TraD fängt das Relaxosomprotein TraM in einem 2- Schritt quallenartigen Mechanismus. Zuerst bindet eines der sechs unstrukturierten Tentakel von TraD an das TraM Tetramer. Anschließend wird das TraM Tetramer noch von 3 weiteren Tentakeln in einem 1:1 Komplex zu TraD hingezogen. Durch die Unstrukturiertheit von TraD ist es möglich bei der Jagd nach TraM ein größeres Volumen abzusuchen. Die einzige geordnete Struktur in der C-terminalen Domäne von TraD ist eine alpha-helikale Region welche an die ATPase TraC bindet. Die Rolle dieser Wechselwirkung wird derzeit von uns untersucht. Im klaren Gegensatz zum Struktur-Funktions Paradigma von Proteinen, ist es die unstrukturierte Domäne von TraD welche offensichtlich den zentralen Regulationsmechanismus steuert.Ein Bereich von nur ~60 C-terminalen Aminosäuren kombiniert zwei wichtige funktionelle Ereignisse in der bakteriellen Konjugation und bindet an zumindest zwei andere Proteine. Zusätzlich wurde in einer Kollaboration die Struktur der TSA Domäne von TraI, einer kombinierten Relaxase und Helikase des Relaxosoms ermittelt und wir fanden dass diese Domäne nicht mit der C-terminalen, regulativen Domäne von TraD wechselwirkt.