Wechselwirkungen zwischen Protein Kinase A und GTPasen

Die Exaktheit Rezeptor-vermittelter Signalkaskaden wird durch ein zeitlich und örtlich reguliertes dynamisches Signalnetzwerk gewährleistet. Solche Netzwerkkaskaden, wie beispielsweise durch die G-Protein gekoppelte Rezeptorsuperfamilie oder Rezeptortyrosinkinasen initiiert, werden gezielt über Rückkopplungs-mechanismen und Quervernetzungen mit anderen Signalwegen reguliert. Signalnetzwerke sind komplex und die Knotenpunkte zwischen diversen Signalwegen werden mittels komplizierter Modelle dargestellt. Aber in manchen Fällen können bestimmte unerwartete molekulare Interaktionen solche Querverzweigungen aufdecken. Aufklärung der physischen Verbindungen dieser Signalwege ist eine Voraussetzung zum Verständnis atypischer Signalweiterleitung. Während meiner Zeit als Postdoc erkannten wir, dass der Protein-fragment complementation assay 1,25 basierend auf dem gelb fluoreszierenden Protein (YFP) es ermöglicht transiente Protein:Proteininteraktionen in vivo zu identifizieren. Wir starteten mit der Identifikation von neuen binären Interaktionen, welche Quervernetzungen und sogenannte Rückkopplungsschleifen in und zwischen cAMP-verknüpften Signalwegen repräsentieren. Das Hauptaugenmerk legten wir auf neue Interaktionspartner bestimmter Untereinheiten der Proteinkinase A (PKA), um die molekularen Mechanismen gegensätzlicher zellproliferierender Effekte und die Beteiligung von beta- adrenergen Rezeptoren zu ergründen. Bisher ist es uns gelungen neue Quervernetzungen zwischen PKA und verschiedenen GTPasen zu identifizieren. Wir konnten neue Protein:Proteininteraktionen identifizieren, welche cAMP-abhängig ausgebildet werden. Daraus folgen wir, dass PKA Untereinheiten möglicherweise GTPase Aktivitäten regulieren. Wir glauben, dass diese neuen PKA:GTPase Komplexe an der von GPCR ausgelösten Übertragung von proliferativen Signalen beteiligt sind. Die Rekonstruktion und Analyse dynamisch agierender Signalübertragung mit einem Fokus auf GTPasen Beteiligung trägt dazu bei, die Arbeitsweise von Signalkaskaden in normalen und malignen Zellen zu verstehen. Wir hoffen dadurch folgende Fragen zu beantworten: WIE und WANN etablieren sich die Vernetzungen von zwei Signalwegen und WIE wird die Information über diese neuen Verknüpfungen weitergeleitet?

Die Spezifität von Membranrezeptor-ausgehenden Signalantworten wird durch räumliches und zeitliches Ineinandergreifen von intrazellulären Signalnetzwerken dirigiert. Diese Netzwerke werden unter anderem durch aktivierte G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) und Rezeptortyrosinkinasen (RTK) gesteuert, wobei es an vielen Eckpunkten der Signalkaskaden zu einem sogenannten Crosstalk mit anderen Signalwegen kommt. Obwohl diese Netzwerke unübersichtlich sind, kann in manchen Fällen Crosstalk durch einfache und gelegentlich auch durch überraschende molekulare Interaktionen erklärt werden. Die Charakterisierung von neuen physischen und funktionellen Verbindungen zwischen exakt kontrollierten Rezeptornetzwerken und involvierten molekularen Schaltern, den Kinasen und GTPasen, war das Hauptziel des FWF Projektes P22608. Wir analysierten Interaktionen zwischen der prototypischen Proteinkinase A (PKA) und den zwei kieinen GTPasen Rac1 und G?i. In der publizierten Studie über die Ausbildung des PKA:Rac Komplex präsentieren wir eine Erklärung wie das second messenger Molekül cAMP an dereguliertem Zellwachstum beteiligt sein kann. Es ist eine Beschreibung wie Komponenten von RTK und GPCR Kaskaden dynamisch interagieren können, um die Signalweiterleitung bis in den Zellkern zu steuern. Des Weiteren charakterisierten wir den PKA:G?i Proteinkomplex. Wir konnten eine unbekannte, neue Funktion den regulatorischen PKA Untereinheiten zuweisen: Nach cAMP-Binding an die regulatorische PKA-Untereinheit wird der Komplex mit G?i ausgebildet. Diese dynamische Interaktion verändert zuerst die Rezeptorsensitivität für den Liganden und steigert dadurch auch die Amplitude von Gai-Rezeptor-vermittelter Signalweiterleitung in humanen Zellen. Der exakte molekulare Mechanismus wurde auch in der Bäkerhefe nachgewiesen. Diese Protein:Proteininteraktion (PPI) wurde zumindest für 1,5 Milliarden Jahre konserviert. Die Ausbildung dieses cAMP-abhängigen Proteinkomplexes repräsentiert einen neuen Mechanismus wie Zellen auf die Änderung ihrer Umgebung reagieren. Neben der Publikation haben wir ein Patent angemeldet und eine Patentapplikation eingereicht, die sich mit dem Aufbrechen des Komplexes beschäftigen. Zudem haben wir den von uns verwendeten PPI-Reporter weiterentwickelt, um Proteinkomplexe zu identifizieren, charakterisieren und auch mit chemischen Wirkstoffen zu modifizieren. Wir zeigten, dass unsere PPI Reporterplattform zudem auch in Modellorganismen, wie etwa der Bäckerhefe, in Zebrafischembryonen und der lebenden Maus verwendet werden kann, um Proteinkomplexe zu untersuchen. Zu guter Letzt haben wir soeben unser PKA-Netzwerkstudie fertiggestellt und das Manuskript eingereicht. Wir beschreiben eine überraschende Interaktion zwischen einem GPCR und der PKA. Es ist dies die Entdeckung des ersten GPCR mit intrinsischer Strukturproteinfunktion für PKA-Bindung.