Domänen-spezifische Beträge zum Cav1.2 Gating

Spannungsabhängig L-Typ Kalziumkanäle (Cav1.2) öffnen bei Membrandepolarisationen (Aktivierung) und durchlaufen anschließend entweder den geschlossenen (ruhenden) oder inaktivierten Zustand. Im Vergleich mit Kaliumkanälen (Kv), die aus vier identischen Untereinheiten (Domänen) bestehen, bestehen Cav1.2 aus 4 strukturell unterschiedlichen Domänen, die miteinander verbunden sind. In meinen früheren Untersuchungen konnte ich zeigen, dass Mutationen einer Region des Segments IIS6 (LAIA Motiv, Hohaus et al. 2005, Beyl et al. 2007, Stary et al. 2008) starke Veränderungen im Aktivierungsverhalten induzieren, wohingegen vergleichbare Mutationen in Segment IS6 geringe Effekte auslösen und häufig zu nicht exprimierenden Kanälen führen (Kudrnac et al. 2009). Diese und andere Daten weisen auf asymmetrische Beiträge verschiedener Kanaldomänen hin und unterstreichen eine besondere Rolle der Domäne II für die Kanalöffnung. Mutationen in Segment IVS6 von CaV scheinen hingegen wichtiger für die Inaktivierung zu sein (Hering et al. 2000). Die molekulare Basis Domän- spzifischer Effekte auf das Kanal "gating" ist nicht bekannt. Sie kann z.B. aus Interaktionen mit benachbarten Porenregionen (z.B IS6-IVS6) herrühren, durch Unterschiede in den Bewegungen der Spannungssensoren bedingt oder durch beides. Es ist nicht auszuschließen, dass der Kalziumstrom vorrangig durch einen einzigen Spannungssensor einer bestimmten Domäne getriggert wird. Es ist auch unklar, ob die Konformationsänderungen während der Aktivierung in benachbarten Domänen voneinander abhängig (d.h. energetisch gekoppelt) sind. Ein wichtiges Ziel meines Projektes ist es aufzuklären, wie strukturelle Unterschiede in den Domänen I-IV das Gating von CaV1.2 beeinflussen und wie diese Domänen interagieren. Neue Gating Determinanten sollen identifiziert und potentielle Interaktionen zwischen ihnen analysiert werden. Ich werde dazu "mutant cycling analysis" (siehe z.B. Kudrnac et al. 2009), Ladungsneutralisation und Ladungsumkehr in IS4-IVS6 Segmenten, Gatingstrommessungen, Fluoreszenz Imaging und homology modelling anwenden. Kinetische Veränderungen, die durch Punktmutationen in Gating-sensitiven Regionen indiziert werden, sollen mit Hilfe eines neuen Cav1.2 Gatingmodells (Beyl et al. 2009) analysiert werden. Die Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten des Cav1.2 Gatings ermöglicht Rückschlüsse, ob Mutationen die spannungsabhängige Bewegung der Spannungssensoren (IS4-IVS4) beeinflussen oder vorrangig spannungsunabhängige Konformationsänderungen in der Porenregion indizieren (Beyl et al. 2009).

Die Aufklärung der Struktur-Funktionsbeziehung von spannungsgesteuerten Kalziumkanälen ist eine der großen Herausforderungen der biophysikalischen und strukturbiologischen Forschung. Am Projektbeginn lag der Fokus des Projekts auf Mutationsstudien der porenbildenden S6 Einheiten, um potentielle unterschiedliche Rollen der einzelnen vier Domänen auf das gating zu untersuchen. Im Rahmen dieser Studien wurden neue Aktivierungsdeterminanten in Helix IIIS6 (G1193, siehe Beyl et al. 2011) und später in anderen Segmenten (Depil et al. 2011) gefunden. In dieser Zeit entwickelten wir auch einen neue Methode (Mutationskorrelationsanalyse) um zu analysieren, wie unterschiedliche physikochemische Eigenschaften der Aminosäuren der porenbildenden S6 Segmente die Aktivierung von CaV1.2 beeinflussen (Beyl et al. 2011). Um funktionelle Änderungen dieser Mutationen zu charakterisieren wurden Homologie Modelle gebaut. Strukturanalysen mit verfeinerten Homologiemodellen zeigten, dass G1193 Bestandteil eines konservierten Rings kleiner Aminosäuren in den porenbildenden S6 Segmenten (G432 (IS6), A780 (IIS6), G1193 (IIIS6), A1503 (IVS6)) ist, der in weiterer Folge als G/A/G/A Ring bezeichnet wird. Eine Hypothese wurde formuliert, nach der diese kleinen Reste mit großen Aminosäuren in benachbarten Segmenten interagieren. Diese Interaktionen bilden sealing points, die zum festen Verschluss des Kanalgates im Ruhezustand beitragen (Depil et al. 2011). Eine funktionell wichtige Einheit des spannungsabhängigen Kanals stellt der Spannungssensor dar. Spannungssensoren lösen die Öffnung der Pore dieser Kanäle aus. Um die Übertragung der Spannungssensorsignale auf die CaV1.2 Pore zu analysieren, wurden alle positiv geladenen Aminosäuren in Helix S4 neutralisiert und die Veränderungen des Gatings analysiert. Neutralisierung aller positiven Ladungen in IIS4 resultierte in funktionellen Kanälen, während die Neutralisierung der S4 Segmente in Domäne I, III und IV zu nicht funktionsfähigen Kanälen führte. Interessanterweise führte die Neutralisierung von Helix IIS6 zu keinerlei Veränderungen der Kanalkinetik (Beyl et al. 2012). Unlängst erhoben wir den überraschenden Befund, dass Störungen des Aktivierungsverhaltens, die durch Mutationen in S6 Segmenten hervorgerufen werden (besonders in der Region des G/A/G/A Rings), durch Neutralisierung der Ladungen eines Spannungssensors (IIS4) behoben werden können. Thermodynamische Analysen bestätigen eine Interaktion des G/A/G/A Rings mit den Spannungssensoren (S4 Segmenten). Dieser Befund eröffnete eine neue Sicht auf das Öffnungs- und Schließverhalten von CaV1.2. Segment IIS4 scheint nicht nur mit seinem S6 Segment der Domäne II zu kommunizieren, sondern interagiert über den G/A/G/A Ring auch mit den S6-Gates der anderen Domänen (IS6, IIIS6 und IVS6). Diesen Mechanismus bezeichnen wir als kooperatives Gating (Beyl et al. 2012). In Beyl et al. 2013 entwickelten wir einen Algorithmus zur Quantifizierung der Interaktionen zwischen Kanalpore (dem Gate) und den Spannungssensoren. Dieses Verfahren ermöglicht erstmalig die Berechnung von Geschwindigkeitskonstanten des Öffnungs- und Schließverhaltens der Kanalpore sowie einer Gleichgewichtigkeitskonstante der Spannungssensoren aus makroskopischer Stromkinetik von CaV1.2. Weitere projektfinanzierte Arbeiten beschäftigten sich mit der Lokalisation der Bindungstasche von Diltiazem (Shabbir et al. 2011).