Mechanismen der Metronidazolresistenz in T. vaginalis

Der mikroaerophile Parasit Trichomonas vaginalis ist der Erreger einer als "Trichomonose" bezeichneten Vaginits bzw. Urethritis im Menschen. Die Trichomonose ist die häufigste nicht-virale und heilbare Geschlechtskrankheit mit ca. 170 Millionen gemeldeten Neuerkrankungen pro Jahr. Die Therapie der Trichomonose basiert fast ausschließlich auf der Gabe von Metronidazol und anderen 5-Nitroimidazolen. Tatsächlich ist Metronidazol praktisch gegen alle anaeroben bzw. mikroaerophilen Pathogene einsetzbar und zählt daher zu den 100 am häufigsten verschriebenen Medikamenten weltweit. Die spezifische Toxizität der 5-Nitroimidazole gegen Anaerobier und Mikroaerophile erklärt sich aus der Notwendigkeit der Reduktion der Nitrogruppe für die Bildung toxischer Metabolite, eine Reaktion die bevorzugt unter weitgehendem Ausschluss von Luftsauerstoff abläuft. In unserer bisherigen Arbeit über die Wirkungsweise von Metronidazol in T. vaginalis entdeckten wir, dass das Flavinenzym Thioredoxinreduktase Nitroimidazole reduzieren kann. Bei einer Zellinie mit hochgradiger, in vitro induzierter, Metronidazolresistenz konnten wir keine Thioredoxinreduktaseaktivität feststellen, obwohl das Enzym exprimiert wurde. Allerdings konnte die Aktivität durch Zugabe des enzymatischen Co-Faktors Flavinadenindinukleotid (FAD) in Enzymaktivitätsmessungen wiederhergestellt werden. Weiters entdeckten wir, dass metronidazolresistente Zellen keine freien Flavine, also Riboflavin, Flavinmononukleotid (FMN) und FAD reduzieren können. Folglich schlossen wir aus unseren Beobachtungen, dass die Reuktion von Metronidazol flavinvermittelt ist, und dass Metronidazolresistenz durch eine schwere Störung des Flavinmetabolismus verursacht wird, welche in geringeren Mengen an reduziertem Metronidazol in der Zelle resultiert. Tatsächlich konnten wir zeigen, dass die direkte Inhibierung flavinabhängiger Reaktionen, inklusive der Reduktion von Thioredoxin durch Thioredoxinreduktase, mit dem Flavininhibitor Diphenyleniodonium zu einer praktisch sofortigen und hochgradigen Resistenz gegenüber Metronidazol führt. Es wird daher Hauptziel dieses Projekts sein, die Zusammenhänge zwischen dem Flavinmetabolismus und der Reduktion von Metronidazol weiter zu beleuchten, und somit unsere Kenntnisse über die Metronidazolresistenz in T. vaginalis zu vertiefen. Zu diesem Zweck wird einerseits die Rolle der Thioredoxinreduktase bei der Reduktion von Metronidazol durch Deletion des entsprechenden Gens direkt untersucht werden. Andererseits werden die intrazellulären Konzentrationen von Riboflavin, FMN und FAD in normalen und metronidazolresistenten T. vaginalis gemessen und miteinander verglichen werden, und jene Enzyme, welche an der Synthese bzw. Reduktion von Flavinen in T. vaginalis beteiligt sind, auf genetischer und biochemischer Ebene in normalen und metronidazolresistenten Zellen untersucht werden.

Die Zielsetzung dieses Projekts war die Identifizierung und Charakterisierung von Faktoren, die zur Metronidazolresistenz im humanpathogenen, mikroaerophilen Protisten Trichomonas vaginalis beitragen. Obwohl das seit mehr als 50 Jahren eingesetzte Metronidazol (Flagyl) auch heute noch ein verlässliches Therapeutikum gegen T. vaginalis darstellt, werden immer wieder metronidazolresitente Trichomonaden aus Patienten isoliert. Da die von T. vaginalis hervorgerufene Trichomonose eine der am weitesten verbreiteten Geschlechtskrankheiten bzw. Parasitosen überhaupt darstellt, ist das Auftreten von resistenten T. vaginalis Stämmen eine beträchtliche medizinische Herausforderung. Frühere, u.a. durch den Projektleiter publizierte Studien legten zwei mögliche Mechanismen der Metronidazolresistenz nahe: 1, eine verringerte Reduktion der Nitrogruppe des Metronidazols, welche für die toxische Wirkung notwendig ist und 2, eine erhöhte intrazelluläre Sauerstoffkonzentration, welche die reduzierte Nitrogruppe reoxidiert und daher zur Entgiftung Metronidazols führt. Im Rahmen dieses Projekts konnte gezeigt werden, dass der erste Mechanismus nur in Laborstämmen mit in vitro induzierter Resistenz von Bedeutung, der zweite Mechanismus hingegen, bei metronidazolresistenten Laborstämmen und Patientenisolaten gleichermaßen beobachtbar ist. Es wurde zudem das Enzym identifiziert und charakterisiert, dessen verringerte Aktivität für die höheren intrazellulären Sauerstoffkonzentrationen verantwortlich ist: eine NADPH-abhängige Flavinreduktase, welche freie Flavine (d.h. FAD, FMN und Riboflavin) reduziert. Reduzierte Flavine, wiederum, reagieren mit Sauerstoff unter Bildung von Wasserstoffperoxid. Dieses Enzym weist in metronidazolresistenten T. vaginalis eine verringerte Aktivität auf oder fehlt sogar völlig. Die Transfektion eines metronidazolresistenten Isolats mit einem episomalen, funktionsfähigen Flavinreduktasegen stellte die ursprüngliche Empfindlichkeit gegenüber Metronidazol wieder fast völlig her. Interessanterweise sind keine näher verwandten Enzyme in anderen Parasiten auf genetischer Ebene bisher identifiziert worden, allerdings konnte im Rahmen dieses Projekts gezeigt werden, dass metronidazolresistente Stämme von Giardia lamblia, einem weiteren humanpathogenen, mikroaerophilen Protisten, ebenfalls eine verringerte Fähigkeit zur Reduktion von freien Flavinen aufweisen. Es ist daher wahrscheinlich, dass die verringerte Reduktion von Flavinen einen bedeutenden Einfluss auf die Entstehung von metronidazolresitenten Parasitenstämmen hat. Diese Erkenntnisse könnten in nicht allzu ferner Zukunft in die Diagnose und Therapie von durch mikroaerophile/anaerobe Erreger hervorgerufenen Infektionskrankheiten einfließen.