Mechanismus des redoxkontrollierten Proteinabbaus

Das Proteasom spielt eine herausragende Rolle beim Abbau von Proteinen in eukaryotischen Zellen. Zahlreiche Krankheiten beim Menschen, wie z. B. Tumorentstehung und neurodegenerative Erkrankungen stehen mit der Aktivität des Proteasoms in Verbindung. In der Regel geht dem Abbau des Zielproteins dessen Markierung durch eine Polyubiquitinkette voraus, die von einem regulatorischen Protein erkannt und in die katalytische Kammer des Proteasoms ("core particle" bzw. 20S Proteasom) eingespeist wird. Kürzlich konnte in Wirbeltierzellen (Mensch & Maus) ein alternativer, Ubiquitin-unabhängiger Abbauweg nachgewiesen werden, der durch die Interaktion einer flavin abhängigen Chinonreduktase (NQO1) mit dem Proteasom gesteuert wird. Diese bislang unentdeckte Regulation des Proteasoms ist möglicherweise entscheidend am Abbau des Transkriptionsfaktors p53, der auch als "Wächter des Genoms" bezeichnet wird, beteiligt und kann daher in wichtige zelluläre Prozesse, wie Transformation und programmiertet Zelltod (Apoptose) eingreifen. In unserer Arbeitsgruppe konnte kürzlich ein homologes System in Saccharomyces cerevisiae, der Bäckerhefe, nachgewiesen werden. Ähnlich zu dem System in Wirbeltierzellen, interagiert auch in der Bäckerhefe eine Flavin-abhängige Chinonreduktase (Lot6p) mit dem 20S Proteasom. Darüberhinaus konnten wir zeigen, dass der Flavinkofaktor (Flavinmononukleotid, ein Derivat des Vitamin B2 ) für die Interaktion der beiden Proteine notwendig ist. Reduktion des Flavinkofaktors (z. B. durch NADH) führt schließlich dazu, daß der Lot6p:20S Proteasom Komplex den Hefetranskriptionsfaktor Yap4p, ein Transkriptionsfaktor der sog. leucine zipper Yeast activator protein Familie, bindet. Die Bildung dieses ternären Proteinkomplexes schützt Yap4p vor proteolytischem Abbau und trägt zu dessen Stabilisierung bei. Durch Oxidation des Flavinkofaktors, z. B. durch zelluläre Chinone, dissoziert Yap4p vom Komplex und wandert in den Zellkern, wo es an der Expression von Genen teilnimmt, die für eine adäquate Stressantwort notwendig sind. Das erste Ziel unseres Projektes wird daher zunächst darin bestehen das Ausmaß dieses redoxkontrollierten Regulationsprozesses zu untersuchen indem wir weitere Proteine (z. B. andere Transkriptionsfaktoren) identifizieren, die einen Komplex mit Lot6p(reduziert) und dem 20S Proteasom bilden können. Anschliessend werden wir die biochemischen Parameter definieren, die für eine derartige Komplexbildung verantwortlich sind. Schließlich werden wir uns durch Bestimmung der dreidimensionalen Struktur mittels Röntgenstrukturanalyse mit der Frage befassen, wie diese Komplexe auf molekularer Ebene gebildet werden und dabei gilt unser besonderes Interesse den durch die Redoxvorgänge verursachten strukturellen Änderungen in der Chinonreduktase. Durch diese Arbeiten werden wir ein molekulares Verständnis für den redox-regulierten, Ubiquitin-unabhängigen proteasomalen Proteinabbau erzielen und gewinnen damit Einblicke in die Erhaltung des zellulären Proteoms. Damit wird es möglich die Rolle des Proteasoms bei der Entstehung von Krankheiten detaillierter zu beschreiben und neuartige therapeutische Ansätze zu entwickeln.

Hinter dem schlichten Namen Chinonreduktase verbirgt sich in Wahrheit ein zelluläres Multitalent: Das Enzym entgiftet nicht nur toxische Chinone sondern stärkt auch die Abwehrkräfte der Zelle und unterdrückt die Entstehung von Tumorzellen. Damit nicht genug macht man sich das Enzym bei der Bekämpfung von Tumoren zunutze indem es für die Aktivierung von Chemotherapeutika eingesetzt wird. Gute Gründe warum jeder Mensch eine stabile und aktive Chinonreduktase sein eigen nennen möchte! Leider ist dies nicht immer der Fall, da in manchen Fällen das Gen Fehler aufweist und es dadurch zur Herstellung von Chinonreduktasen mit eingeschränkter Funktion kommt. Besonders häufig tritt dabei ein Austausch des DNA-Bausteins Cytosin in Position 465 bzw. 609 zu Thymin auf. Beide Austausche führen zur Bildung von Enzymvarianten die entweder in Position 139 anstelle der Aminosäure Arginin ein Tryptophan (R139W Variante) bzw. in Position 187 anstelle der Aminosäure Prolin ein Serin (P187S Variante) besitzen. Ob und wie sich diese Aminosäureaustausche auf die Eigenschaften des Enzyms auswirken war Gegenstand des Forschungsprojektes. Dazu wurden beide Varianten in Bakterien künstlich hergestellt und für wissenschaftliche Laborversuche gereinigt. Dabei wurde schnell deutlich, dass die P187S Variante erheblich an Aktivität eingebüßt hatte. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Fähigkeit dieser Variante den benötigten Kofaktor zu binden Schaden genommen hatte. Dieser Befund war sehr verwunderlich, da sich der Aminosäureaustausch abseits der Bindetasche des Kofaktors befindet und daher keinen Einfluss auf die Bindung des Kofaktors haben sollte. Es stand daher die Frage im Raum ob der Aminosäureaustausch zu einer allgemeinen Veränderung der Proteinstruktur führt. Um diese Frage zu klären wurde die Struktur der P187S Variante kristallographisch gelöst und mit der bereits bekannten Struktur der Chinonreduktase verglichen. Dabei stellte sich heraus, dass die beiden Strukturen sehr ähnlich sind und daher keinen Aufschluss über die Ursache der verringerten Funktionsfähigkeit der P187S Variante ergeben. Um diesen unerwarteten Befund aufzuklären wurden weitere Untersuchungen durchgeführt bei denen es möglich war die Struktur des Proteins in Lösung zu beobachten und nicht wie im vorangegangen Experiment in einem "eingefrorenen" Kristall. Dadurch konnte eindeutig gezeigt werden, dass die P187S Variante strukturell instabil ist und damit ein Verlust der Aktivität einhergeht. Dieser ursächliche Zusammenhang zwischen dem Aminosäureaustausch in der menschlichen Chinonreduktase und dem Verlust an Funktion stellt eine wichtige Erkenntnis dar, die für die Entwicklung möglicher Wirkstoffe zur Stabilisierung der P187S Variante genutzt werden kann. Im Gegensatz zur P187S Variante ergaben unsere Untersuchungen mit der R139W Variante keinen Hinweis auf funktionale Veränderungen so dass dieser Aminosäureaustausch keine nachteiligen Konsequenzen bewirkt. In einem allgemeineren Zusammenhang hat unsere detaillierte Charakterisierung der P187S Variante auch gezeigt, dass kristallographische Strukturen nicht notwendigerweise die Struktur und Dynamik eines Proteins in Lösung widergibt. Daher sind unsere Erkenntnisse nicht nur speziell für die Chinonreduktase sondern den gesamten Bereich der Proteinbiochemie von Bedeutung.