Mechanismen der transkriptionellen Kontrolle durch EWS-FLI1

Das für Ewing Sarkome (ESFT) charakteristische Protein EWS-FLI1 ist der Prototyp eines kausal in die Onkogenese verwickelten aberranten ETS Transkriptionsfaktors. Die Mechanismen der ETS-vermittelten Tumorbildung, sind kaum verstanden. In vorangegangenen Projekten testeten wir eine Forschungsstrategie, die von der Gewinnung genomischer Daten über die bioinformatische Hypothesengenerierung zur funktionellen Aufklärung EWS-FLI1 assoziierter transkriptioneller Netzwerke führt. Auf die Entzifferung und funktionelle Zuordnung der transkriptionellen EWS-FLI1 Signatur folgte die Charakterisierung der Promoterarchitektur von EWS-FLI1 induzierten sowie unterdrückten Genen. Die Promoterregionen von EWS-FLI1 aktivierten Genen, welche vor allem Funktionen der Proliferation zugeordnet werden können, erwiesen sich als mit ETS Bindungsstellen angereichert. Diese Motive sind hingegen in den Promotoren von EWS-FLI1 unterdrückten Genen, welche vornehmlich mit Differenzierungsprozessen assoziiert sind, unterrepräsentiert. Dies lässt vermuten, dass EWS-FLI1 induzierte Gene mit direkten EWS-FLI1 Zielgenen angereichert sind. Die in-silico Analyse von zeitaufgelösten Expressionsdaten enthüllte die gemeinsame Anreicherung von ETS, E2F und NFY Bindungsmotiven in frühen EWS-FLI1 aktivierten Genen, während EWS-FLI1 unterdrückte Gene eine Anreicherung von Erkennungsmotiven für "forkhead box" (FOX) und NFKB Proteinen aufwiesen. Genom-weite Chromatin Immunpräzipitationsexperimente mit anschließender Hochdurchsatzsequenzierung (ChIP-seq) bestätigten die Anreicherung von EWS-FLI1 und E2F3/4 auf EWS-FLI1 induzierten Genen und ihre Kolokalisation in etwa 50% von E2F Zielgenen. Reportergen Assays für mehrere Zielgene bestätigten auch auf funktioneller Ebene Koregulation dieser Gene durch EWS-FLI1 und E2F. Diese Resultate validieren unseren Ansatz zur Aufdeckung des Transkriptions-faktornetzwerks um EWS-FLI1. Dieser Forschungsstrategie folgend schlagen wir nun vor, Hypothesen betreffend wesentlicher vermuteter Effektoren EWS-FLI1 vermittelter transkriptioneller Regulation, welche wir in unseren vorhergehenden Studien identifiziert haben, zu überprüfen: 1. EWS-FLI1 kooperiert synergistisch mit E2F und/oder NFY auf Proliferations-assoziierten Genen 2. EWS-FLI1 vermittelt Genrepression durch Hemmung von FOX und NFKB Aktivierung Die beiden Hypothesen sollen funktionell, mittels ektopischer Expression, RNA Interferenz (RNAi) und Reportergen Assays kombiniert mit Mutationsanalyse getestet, und strukturell mittels Chromatin- und Protein Koimmunpräzipitation überprüft werden. Wir werden den Einfluß von rekombinanter DNA- und Drogen- induzierter Modulation dieser vermuteten EWS-FLI1 koregulierenden (NFY) oder nachgeschalteten (FOX und NFKB) Faktoren auf die transkriptionelle Signatur von EWS -FLI1, in-vitro ESFT Zelllinienwachstum und - differenzierung, und in-vivo Tumorbildung studieren. Dieses Projekt wird erstmals die Mechanismen der Transkriptionsfaktorinteraktion in ETS-getriebener Onkogenese untersuchen. Die erwarteten Resultate können zukünftige therapeutische Strategien zur Störung der EWS-FLI1 Funktion in ESFT und möglicherweise anderen Krebserkrankungen steuern, in welchen aberrante ETS Transkriptionsfaktoren eine wesentliche Rolle spielen.

Das Ewing Sarkom ist ein äußerst bösartiger Knochentumor bei Kindern und Jugendlichen. Seine Entstehung ist Folge einer Genumlagerung, welche zur Bildung eines DNAbindenden Fusionsproteins führt, dem ETS Transkriptionsfaktor EWSFLI1. In diesem Projekt konnten wir zwei neuartige Mechanismen der krankhaft veränderten Genexpression als Folge der EWSFLI 1 Aktivität aufklären. Es konnte gezeigt werden, dass EWSFLI1 DNABindung nahe dem Startpunkt von Genen, welche die Zellteilung vorantreiben, mit Aktivierung verbunden ist, während die Bindung an die DNA in großemAbstand mit der Unterdrückung von Differenzierungsgenen assoziiert ist. Für die Aktivierung von Zellwachstums fördernden Genen definierten wir ein neuartiges Regulationsmodul, in dem EWSFLI1 Bindung zum Austausch eines hemmenden Transkriptionsfaktors der E2F Familie (E2F4) durch ein aktivierendes E2F Familienmitglied (E2F3) auf dem Genpromoter führt. Wir konnten zeigen, dass dieses Modul nichtallein für Ewing Sarkome spezifisch ist, sondern auch beim Prostatakrebs angetroffen wird, in dem ein verwandter ETS Transkriptionsfaktor (ERG) durch Genumlagerung aktiviert ist. Genpromotoren, die durch EWSFLI1 im Ewing Sarkom unterdrückt werden, zeigten hingegen eine Anreicherung von Erkennungsmotiven für Transkriptionsfaktoren der Forkheadbox (FOX) Familie. Wir identifizierten FOXO1 als den Schlüsselfaktor, dessen EWSFLI1 abhängig veränderte Expression für die krankhafte Unterdrückung vieler Gene verantwortlich ist. Es wurde gezeigt, dass EWSFLI1 FOXO1 auf zwei Ebenen unterdrückt: Einerseits vermindert es die FOXO1 RNA Transkription, andererseits verhindert es durch Aktivierung zweier Proteinmodifizierender Enzyme, CDK2 und PI3K, den Import von FOXO1 in den Zellkern. Um das therapeutische Potential unseres Ergebnisses zu überprüfen, setzten wir exemplarisch Methylselensäure als eine FOXO1 reaktivierende Substanz ein und demonstrierten so invitro und im Xenograft Mausmodell, dass pharmakologische Aktivierung von FOXO1 zu Ewing Sarkom Zelltod und dadurch zu vermindertem Tumorwachstum führt. Damit liefert das abgeschlossene Projekt nicht nur wesentliche neue Erkenntnisse über onkogene Wirkungsmechanismen, die über das Ewing Sarkom hinausgehen, sondern es konnte auch ein innovativer Ansatzpunkt für zukünftige neue therapeutische Strategien aufgezeigt werden.