Transkriptionsfaktor-Netzwerke in Blut-Stammzellen

Alle reifen Zellen des Blutes entstehen aus wenigen pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen (HSC). HSC können sich sowohl als unreife Stammzellen selbst erneuern, als auch in reife Blutzellen ausdifferenzieren. Die hierarchische Organisation des hämatopoetischen Systems ist relativ gut charakterisiert, und auch die Funktionen vieler in diese Vorgänge involvierten Gene sind bekannt. Die logischen Regelkreise und Verknüpfungen der Komponenten, die für die Proliferation und Pluripotenz von HSC verantwortlich sind, sind jedoch weitgehend unbekannt. Wir schlagen vor, regulatorische Transkriptionsfaktor-Netzwerke in HSC zu analysieren und zu validieren. Ermöglicht wird dieses Projekt durch die Weiterentwicklung von modernen Technologien und durch die Einbettung des Antragstellers in eine perfekt organisierte Arbeitsgruppe mit langjähriger Erfahrung in funktioneller Proteomik, Genomik und Bioinformatik. Weiters besteht eine enge Kollaboration mit einer klinischen Abteilung für Hämato- Onkologie. Wir beabsichtigen, markierte Versionen von 8 Transkriptionsfaktoren in hämatopoetische Progenitoren der Maus einzubringen. Alle ausgewählten Kandidaten spielen wichtige Rollen in der Funktion von normalen und malignen Stammzellen. Durch Tandemaffinitätsaufreinigung in Kombination mit Massenspektrometrie (TAP-MS) werden wir HSC-spezifische Transkriptionsfaktor-Komplexe charakterisieren. Dieser Schritt wird die Zuordnung von einzelnen Komponenten zu verschiedenen Proteinkomplexen ermöglichen ("HSC-Interaktom"). Weiters werden wir die Genom-weite Chromatin-Assoziation dieser Komplexe sowie deren Einfluss auf die Genexpression, durch Chromatin-Immunpräzipitation und DNA-Sequenzierung als auch mRNA-Expressionsanalysen aufklären (das "HSC Regulom"). Durch bioinformatische Analyse werden diese beiden verschiedenen Datensätze in ein Interaktions- und Regulations-Netzwerk integriert werden (das "HSC Regulo-Interaktom"), welches Einblicke in die koordinierten Wirkmechanismen von verschiedenen Proteinkomplexen geben wird, die das transkriptionelle Programm von HSC steuern. In weiterer Folge werden wir dieses Netzwerk durch biochemische und funktionelle Tests validieren. Ausgewählte Protein-Protein Interaktionen werden einer detaillierten biochemischen Charakterisierung unterzogen werden. Eine wichtige Eigenschaft von normalen und leukämischen Stammzellen ist das Potenzial sich als unreife Zellen zu teilen. Durch einfache in vitro-Systeme werden wir testen, wie die von uns identifizierten neuen Komponenten diese Eigenschaft von HSC beeinflussen. Des weiteren werden wir Material von Patienten mit verschiedenen hämatologischen Erkrankungen auf die etwaige Anwesenheit von genetischen Aberrationen in den ausgewählten Genen überprüfen. Das Ziel dieses integrativen Projekts ist die Aufklärung von molekularen Regelkreisen, die die Eigenschaften von HSC steuern. Die Entdeckung von neuen Faktoren und Mechanismen soll dazu beitragen, neue Waffen im Kampf gegen Krebs zu finden.

Akute myeloische Leukämie (AML) ist eine aggressive Form von Blutkrebs. Obwohl in den letzten Jahren deutlich wurde, dass Mutationen in bestimmten Genen maßgeblich an der Leukämieentstehung beteiligt sind, ist es in vielen Fällen unklar, wie diese Genmutationen zelluläre Vorgänge verändern können, um letztlich Krebs auszulösen. Daher ist ein besseres Verständnis der den Mutationen zugrunde liegenden molekularen Mechanismen für die Entwicklung besserer therapeutischer Strategien entscheidend.Der Transkriptionsfaktor CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBPa) ist ein wichtiger Regulator der Granulozyten-Differenzierung. In 9% aller Patienten mit AML ist das C/EBPa-Gen mutiert. Allerdings verursachen diese Mutationen keinen vollständigen Proteinverlust, sondern die Expression einer verkürzten Variante des Proteins (p30), die wahrscheinlich veränderte Funktion hat. Die Expression von p30 induziert erhöhte Proliferationskapazität und blockiert granulozytische Differenzierung. Die molekularen Mechanismen, die diesen p30-spezifischen Funktionen zugrunde liegen, sind jedoch nicht vollständig verstanden. Durch die Verwendung eines integrierten Ansatzes bestehend aus Genexpressionsanalysen, Affinitätsaufreinigung gekoppelt mit Massenspektrometrie und Chromatinimmunpräzipitation gefolgt von Hochdurchsatzsequenzierung (ChIP-seq), konnten wir zeigen, dass die Leukämie-assoziierte p30-Variante - jedoch nicht das Wildtyp-C/EBPa Protein - über das Protein Wdr5 spezifisch mit dem MLL Proteinkomplex interagiert. Das MLL-Protein ist eine Histonmethyltransferase, die durch eine Dreifach-Methylierung der Seitenkette von Lysin-4 auf Histon H3 (H3K4me3) in aktiven Promotoren als positiver Regulator von transkriptionellen Prozessen wirkt. shRNA-vermittelte Suppression von Wdr5 konnte den p30-induzierten Differenzierungsblock aufheben und erniedrigte die p30-abhängige, erhöhte Proliferationskapazität von primären Zellen aus p30/p30-Mäusen. ChIP-seq Studien zeigten, dass p30 größere Überlappung als das Wildtyp-C/EBPa Protein mit H3K4me3-markierten genomischen Regionen aufwies. Dies weist darauf hin, dass p30 spezifische Wege der Transkriptionsregulation verwenden kann, die unterschiedlich zu denen des Wildtyp C/EBPa Proteins sind. Schließlich fanden wir, dass p30-exprimierenden Zellen eine spezifische Sensitivität gegenüber einem niedermolekularen Inhibitor (MI-2), der die MLL-Menin Interaktion stört, aufweisen. Behandlung von Zellen mit MI-2 induzierte Proliferationsarrest und terminale myeloide Differenzierung. Globale Genexpressionsanalysen zeigten, dass die Expression von p30-abhängigen Zielgenen durch Behandlung mit MI-2 herunterreguliert wird. Insgesamt schlagen unsere Ergebnisse einen neuen Mechanismus der p30-abhängigen Leukämieentwicklung vor und validieren den MLL-Komplex als therapeutisches Ziel bei AML mit C/EBPa-Mutationen. Diese Arbeit kann erhebliche Auswirkungen auf die Entwicklung von zielgerichteten Strategien zur Hemmung des MLL-Komplexes in AML haben.