Posttranslationale Modifikationen von Proteinen des Gehirns

Gehirn und Nervengewebe enthalten eine besonders reichhaltige Auswahl ungewöhnlicher, protein-gebundener Glykane, deren funtionelle Rolle erst ungenügend beleuchtet wurde. Wir gehen von der Hypothese aus, dass eine bessere Kenntnis der Proteinglykosylierung im Gehirn und insbesondere die Beobachtung entwicklungs- bzw. krankheitsabhängiger Veränderungen derselben, zum Verständnis der Gehirnfunktion wesentlich beiträgt, Das vorliegende Projekte zielt auf die Messung der N- und O-Glykane von Mäusegehirn Glykoproteinen mittels einer neuartigen, isomer-spezifischen Technik ab, welche qualitative und quantitative Ergebnisse von minimalen Probenmengen ermöglicht. Es handelt sich dabei um die vor kurzem in unserer Gruppe entwickelte Methode, bei der eine "graphitic carbon" Säule zur Trennung der Glykane dient, welche dann massenspektroskopisch analysiert werden. Das Objekt der Untersuchungen werden die Proteine CD24 and L1 sein, die im Mäusegehirn für das Auswachsen von Neuriten wichtig sind. Prof. Melitta Schachner von der Universität Hamburg wird uns mit zu ausgewählten Zeitpunkten genommenen Proben versorgen. Neuere Ergebnisse dieser Gruppe zeigten, dass die Funktion dieser Proteine zu einem guten Teil auf Protein-Kohlenhydrat-Wechselwirkungen beruht. In einer ersten Phase sollen die Bedingungen für die instrumentelle Analytik der Glykane mittels LC-ESI-MS optimiert werden. Die zweite Phase befasst sich mit der eigentlichen Strukturanalysen der wichtigsen Glykane. Zusätzlich zu den übliche massenspektroskopischen Verfahren, wollen wir Referenzglykane mit bekannter Struktur einsetzen. Diese werden durch Verwendung spezifischer Glykosyltransferasen hergestellt, was sich bereits bei der Analyse biantennärer N-Glykane als sehr nützlich erwiesen hat. Es sollen somit die tatsächlichen Strukturen der vorkommenden N- und O-Glykane aufgeklärt werden und nicht nur ihre Zusammensetzung. In der letzten Phase schliesslich werden die so entwickelten Fähigkeiten auf die Proben aus Hamburg angewand, um allfällige Veränderungen während der Gehirnentwicklung messen zu können. Wahrscheinlich wird es mit der neuen Techniken auch möglich werden, die Liganden-Spezifität von L1 festzustellen.

Kürzlich wurden Hinweise für die Wichtigkeit bestimmter Zucker-Determinanten auf Glykoproteinen bei Gehirnentwicklung und Lernvorgängen in der Maus veröffentlicht. Dabei dürften Determinanten mit dem Zucker Fukose eine besondere Rolle spielen. Da die Aussagekraft klassischer Experimente mit Lektinen unzureichend ist, steigt das Bestreben nach instrumenteller Analytik, konkret nach der Kombination aus Flüssigchromatographie (LC) und Massenspektrometrie (MS), bei der die vom Protein getrennten Glykane zunächst nach ihrer Struktur aufgetrennt werden. Dann werden Masse und für die Strukturanalyse das Fragmentmuster bestimmt. Allerdings muss schon man im Falle eines einzigen Glykans im Mausgehirn, das aus 5 Hexosen, 4 Hexosaminen und einer Fukose besteht, bereits mit etwa 40 verschiedenen Isomeren rechnen, also Glykanen, welche die gleiche Masse, aber eine andere Struktur besitzen. Wir konnten im Rahmen des Projektes zeigen, dass ein vielversprechender Weg zur verlässlichen Strukturaufklärung über die chromatographische Trennung der Isomere geht. Dazu müssen Retentionszeiten und Fragmentmuster der möglichen Isomere ermitteln werden und das war ein Hauptgegenstand des Projektes. Mithilfe von 11 von uns gentechnisch erzeugten Glykosyltransferasen konnten wir bereits einen großen Teil der 40 möglichen Strukturen herstellen. Diese uns naheliegende Auswahl deckte aber noch nicht alle Peaks des Maushirns ab, was die Ungewöhnlichkeit der Maus-Strukturen unterstreicht. Da angesichts der Vielzahl möglicher Isomere die Zuordnung eines auftauchenden Peaks heikel ist, arbeiteten wir daran diese durch Einsatz interner Standards verlässlicher zu machen. Zwei Strategien zur Einführung von schweren Isotopen in die Glykan-Standards wurden entwickelt. Der Einbau von Zuckern in Glykane erfolgt über aktivierte Vorstufen. Für die hier wichtigen Zucker gab es aber keine Isotopen-markierten Präparate zu kaufen, sodass wir die 13C-markierte, aktivierte Galaktose erst erzeugen mussten, wiederum mit gentechnisch hergestellten Enzymen. Damit gelang es, die weltweit ersten isotopen-markierten Standards für die Glykan-Analyse mit LC-MS herzustellen. Diese sind Voraussetzung für jede weitere sinnvolle Arbeit auf diesem Gebiet.