Weiterentwicklung der Weitfeld CARS Mikroskopie

Ziel des Projektes ist es, eine von unserer Gruppe eingeführte neue Methode der sogenannten "Weitfeld Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) Mikroskopie" entscheidend weiterzuentwickeln um eine höhere Effizienz, einen erweiterten zugänglichen Bereich der abbildbaren Raman Resonanzen und einen weiter verbesserten Signal- zu-Hintergrund Kontrast zu ermöglichen. Damit hat unsere Methode das Potential, sich als eine Schlüsseltechnologie in der biomedizinischen Mikroskopie und in der Materialforschung zu etablieren. Die Effizienz eines CARS Signals ist zur Zeit ein limitierender Faktor für die Abbildung minimaler Menge chemischer Substanzen in biologischen Proben oder in der Materialforschung. Daher planen wir unser in einem früheren FWF Projekt entwickeltes Weitfeld CARS Mikroskop in dieser Hinsicht weiter zu optimieren. Die grundsätzliche Idee dazu besteht darin, die bisher verwendete CARS Anregungsgeometrie zu ändern indem ein speziell entwickeltes Phasengitter, oder ein Diffraktives optische Element, im Pumpstrahlengang implementiert wird. Hierdurch wird eine neue Winkelverteilung des Anregungslichts erreicht, womit die sogenannte "wave matching condition", die zur Erzeugung eines effizienten Signals nötig ist, optimal erfüllt werden kann. Numerische Abschätzungen hierzu legen nahe, dass auf diese Weise eine mindestens 10-fache Signalerhöhung bei gleichbleibender Anregungsintensität erreicht werden kann. Nachdem wir inzwischen etwa 5 Jahre Erfahrung mit unserer Weitfeld CARS Anordnung haben, sind wir nun auch in der Lage, die technischen Komponenten zu identifizieren, die unsere erreichbare Abbildungsqualität entscheidend beeinflussen. Wir planen daher, unser System mit den optimalen Anregungs- und Detektionstechniken auszustatten. Dies betrifft insbesondere eine Adaption unseres Lasersystems um höhere Anregungsintensitäten zu erreichen und die Implementation eines neuen Kamerasystems, das im verwendeten Wellenlängenbereich wesentlich empfindlicher ist und eine weitaus höhere Bildqualität ermöglicht. Diese Weiterentwicklungen sollten es letztendlich ermöglichen, hochauflösende und kontrastreiche Abbildungen der Verteilung unterschiedlichster chemischer Substanzen in biologischen Zellen aufzunehmen, wie z.B. die Verteilung von Fetten, Proteinen, oder aus der Umwelt aufgenommenenr Substanzen wie Medikamenten oder Nanoteilchen. Wir denken, dass sich unsere spezielle CARS Mikroskopie Variante mit diesen Verbesserungen zu einer wichtigen Ergänzung der modernen Bioimaging Verfahren entwickeln wird.

Die Kohärente anti-Stokes Raman (CARS)-Mikroskopie.ist eine relative neue chemisch selektive bildgebende Technik: Durch Beleuchten mit Laserstrahlen werden bestimmte chemische Bestandteile der Probe gezielt zum Leuchten gebracht, wobei Licht emittiert wird, das zu kürzeren Wellenlängen verschoben und damit gut detektierbar ist. Dieses Phänomen tritt auf, wenn die Differenzfrequenz der eingestrahlten Laser genau einem Vibrationsübergang der ausgewählten Moleküle entspricht. Im Gegensatz zur Fluoreszenz- Mikroskopie muss in der CARS-Bildgebung die Probe nicht gefärbt werden, weshalb sie eine alternative oder ergänzende Methode für Anwendungen in der biomedizinischen Forschung und in den Materialwissenschaften darstellt, wenn Messungen an einer unbehandelten Probe notwendig sind.Im Zuge des FWF-Projekts Advanced Wide-Field CARS-Microscopy wurde die Weitfeld- CARS-Mikroskopie in Richtung höhere Effizienz, Sensitivität und auch Flexibilität weiterentwickelt. Dies wurde erreicht, indem die Wellenfronten der Laser durch ein Beugungsgitter oder für höchste Flexibilität von einem programmierbaren räumlichem Lichtmodulator (Spatial Light Modulator, SLM) verändert werden. Dies erlaubt einfaches Auswählen der chemischen Resonanzen, sowie die genaue Einstellung der sogenannten Phasenanpassung (phase matching), die die Effizienz der Signalerzeugung bestimmt. Als Demonstrationsbeispiel dafür wurden kleine Kunststoff-Teilchen, die in einer Substanz mit ähnlichem spektralem Verhalten eingebettet sind, durch gezielte Änderung der Phasenanpassung detektierbar gemacht.Nach der Demonstration des Leistungsvermögens des neuen Weitfeld-CARS-Mikroskops an einfachen Proben wurde es für zwei biomedizinische Anwendungen verwendet: Das System wurde bei der Untersuchung der kontrollierten Freisetzung von Fluoreszenz-Markern aus Nano-Carriers in Innenohrzellen als Kontrollverfahren an der unbehandelten Probe verwendet. Die zweite Anwendung ist die färbungsfreie native Bildgebung an Maus-Hirn- Schnitten mit dem Ziel, alpha-Synuclein-Partikel nachzuweisen, die in Zusammenhang mit neurodegenerativen Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson stehen.