Thionin Prozessierung

Thionine sind antimikrobielle Peptide welche aus verschiedenen Pflanzenarten isoliert wurden, insbesondere aus verschiedenen Misteln sowie Samen und Blättern von Getreidearten. Thionine sind im allgemeinen basich mit ca. 45 Aminosäuren und besitzen eine kompakte dreidimensionale Struktur welche durch 3 bis 4 Disulfidbrücken stabilisiert wird. Sie haben antimikrobielle und toxische Wirkungen die anscheinend auf einer Zerstörung von Zellmembranen beruhen. Thionine werden in der Pflanzenzelle als Präproproteine synthetisiert. Die Signalsequenz leited das Proprotein in den zellulären Sekretionsweg. Das Proprotein besteht neben dem eigentlichen Thionin aus einer sogenannten sauren Domäne. Diese ist im Gegensatz zum basischen Thionin sauer und besitzt ebenfalls (meist 6) konservierte Cysteinreste. In diesem Projekt soll die Prozessierung des Proproteins untersucht werden. Dazu soll zunächst aus Gerste die entsprechende Proteinase gereinigt werden. Anhand der Sequenz sollen dann das/die Arabidopis Enzym/e identifiziert und untersucht werden. Vor allem soll mit Hilfe der Massenspektroskopie geklärt werden, wo genau die Prozessierung erfolgt und welche Auswirkungen ein Ausfall des Enzyms bzw. der Enzyme auf die Thionin Proproteine hätte. Mit Hilfe von Antikörpern soll untersucht werden wo diese Proproteine sich in der Zelle anreichern.

Thionine sind pflanzenspezifische antimikrobielle Peptide die hauptsächlich in Samen und Blättern von Gräsern und Misteln vorkommen. Sie sind gewöhnlich basisch, haben ein Molekulargewicht von ca. 5 kDa und sind aufgrund von drei bis vier Disulfidbrücken sehr stabil. Thionine werden als Präproproteine synthetisiert, bestehend aus einem Signalpeptid, dem eigentlichen Thionin und einer sogenannten sauren Domäne. Bis heute wurden aus Pflanzen nur die reifen Thionine isoliert, während ein Protein entsprechend der sauren Domäne nie gefunden wurde. Ziel dieser Arbeit war es, das Thionin Proprotein prozessierende Enzym (TPPE) zu identifizieren und zu charakterisieren. Hierfür wurden etiolierte Gerstenkeimlinge gewählt, da bekannt war, dass diese große Mengen an blattspezifische Thioninen enthalten. Um sicherzustellen, dass die blattspezifischen Thionine tatsächlich das vorhergesagte C-terminale Ende besitzen, wurde das Thionin BTH6 aus etiolierten Gerstenkeimlingen isoliert und das vermutete C-terminale Ende bestätigt. Mithilfe eines Fluoreszenz-markierten Substrates, welches aus einem Teil der Aminosäure Sequenz zwischen dem Thionin und der sauren Domäne bestand, wurde die Subtilisin Protease BAJ93208 aus etiolierte Gerstenkeimlingen isoliert und als TPPE identifiziert. Die Protease wurde in E. coli exprimiert und gereinigt. Es konnte gezeigt werden, daß das Enzym autokatalytisch 2 Bereiche am N-Terminus abspaltet und dadurch zur vollen Aktivität gelangt. Das BTH6 Proprotein wurde ebenfalls in E. coli exprimiert. Bei Prozessierung durch TPPE wird die saure Domäne an mehreren Stellen gespalten und das Thionin mit dem natürlich vorkommenden C-Terminus freigegeben. Diese Zerstückelung der sauren Domäne erklärt warum ein der sauren Domäne entsprechendes Protein niemals aus Pflanzen isoliert wurde. Wird die räumliche Struktur des BTH6 Proprotein vor der Prozessierung durch Reduktion der Disulfidbrücken aufgelöst, so wird auch das Thionin durch die TPPE an mehreren Stellen gespalten. Die kompakte räumliche Struktur der Thionine ist also nicht nur für die Funktion wichtig, sondern hat auch eine Schutzfunktion während der Prozessierung des Proproteins.