Analyse von Orb2 und dessen Rolle für Langzeitgedächtnis

Das Langzeitgedächtnis der Fruchtfliege Drosophila ist stark von der Funktion des CPEB (cytoplasmic polyadenylation element-binding) Proteins Orb2 abhängig. In Versuchen mit Courtship Conditioning zeigen orb2 Mutanten, selbst nach längeren Trainingseinheiten, ein normales Kurz- aber kein funktionelles Langzeitgedächtnis. Von anderen CPEB Proteinen ist bekannt, dass sie mRNA -Transport und -Translation regulieren. Da manche CPEB Proteine in neuronalen Synapsen lokalisiert wurden, basiert unsere Arbeitshypothese auf der Annahme, dass orb2 die Translation in Synapsen (mit)reguliert. Unser Ziel ist es die genauen Mechanismen, mit Hilfe derer Orb2 zur Bildung eines Langzeitgedächtnisses beiträgt, sowohl auf molekularer als auch auf zellulärer Ebene zu beschreiben. Aus diesem Grund wurde von uns ein System zur schnellen Modifikation des endogenen orb2 Locus etabliert. Dieses System soll es ermöglichen alle erdenklichen Veränderungen des endogenen Orb2 Proteins vorzunehmen um seine Funktion in vivo zu analysieren. Zum Beispiel ist geplant Orb2 mit Epitopen zu markieren um festzustellen ob es ein synaptisches Protein ist, und falls ja, ob es pre- oder postsynaptisch lokalisierbar ist. Weiters ist geplant die Eigenschaften eines photoaktivierbaren GFP Tags zu nutzen um dynamische Eigenschaften der Orb2 Lokalisation zu ergründen. Wir planen diese Strategie auch zur Erforschung der molekularen Grundlagen von Orb2 in der Bildung des Langzeitgedächtnisses anzuwenden, um herauszufinden welche Eigenschaften universell für Orb2 sind, und welche mit anderen Mitgliedern der CPEB Familie geteilt werden. Dazu wollen wir bestimmte Domänen mutieren, und sie sowohl einzeln als auch in Kombinationen gegen (homologe) Domänen anderer CPEB Proteine austauschen. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass alle diese Modifikationen im endogenen Locus vorgenommen werden um eine präzise räumliche und zeitliche Expression zu gewährleisten, um so verlässlich zu evaluieren wie diese Modifikationen die molekularen und zellulären Eigenschaften von Orb2 verändern. Parallel dazu werden wir die endogen markierten Orb2 Proteine nutzen um Interaktionspartner von Orb2 ausfindig zu machen. Diese werden mit Hilfe der markierten Proteinen von Fliegenhirnen immunoprezipitiert und die gefundenen Komplexe mit massenspektrospkopischen Methoden analysiert. Gefundene Kandidaten werden in Folge mit Hilfe von RNAi knock-downs auf ihre Rolle in der Bildung des Langzeitgedächtnisses in Courtship Conditioning Versuchen genauer untersucht. Diese Versuche sollten es ermöglichen ein tiefer gehendes Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen von Orb2 in der Bildung des Langzeitgedächtnisses in Drosophila zu erlangen.

Die meisten Verhaltensweisen können durch Lernprozesse verändert werden, was dem Individuum ermöglicht, sein angeborenes Verhaltensrepertoire an spezifische Umweltbedingungen anzupassen. Abhängig von Dauer, Intensität und Bedeutsamkeit der Lernerfahrung, können Erinnerungen entweder im Kurz- oder Langzeitgedächtnis gespeichert werden. Diese Verhaltensmodifizierung reflektiert die anatomischen und funktionalen Veränderungen an spezifischen Synapsen. Langzeit- Plastizität erfordert die Synthese neuer Proteine sowohl im Zellkörper, wie auch lokal an der Synapse. Kandidaten für die Regulierung lokaler Proteinsynthese sind z.B. die Mitglieder der CPEB (Cytoplasmic Polyadenylation Element Binding) Familie. In Aplysia hält CPEB die synaptische Bahnung aufrecht, die physiologische Entsprechung des Langzeitgedächtnisses- wahrscheinlich mittels seiner Prion-ähnlichen Eigenschaften, die ihm eine glutamatreiche Q-Domäne verleiht. Wie wir bereits nachweisen konnten, wird das Langzeitgedächtnis in Drosophila durch das Drosophila CPEB Orb2 herbeigeführt, und ist abhängig vom Vorhandensein dessen Q-Domäne. Um die zelluläre und molekulare Funktion von Orb2 in Lern- und Erinnerungsprozessen in Drosophila besser zu verstehen, führten wir detaillierte genetische, biochemische und Verhaltensanalysen durch, zur Bewertung der Rolle des endogenen Orb2 Proteins in einer natürlich vorkommenden Lernweise in Drosophila, der Konditionierung des Balzverhaltens. Diese robuste Modifizierung der Paarungsstrategie in Fliegen basiert darauf, dass Männchen durch Erfahrung lernen, selektiv paarungsbereite Weibchen zu umwerben, um ihren Fortpflanzungserflog zu erhöhen. Wir fanden, dass zwei Orb2 Isoformen, Orb2A und Orb2B, zur Hervorbringung von Langzeit-Erinnerungen beitragen, jedoch durch unterschiedliche Mechanismen. Während beide Isoformen die gleiche RNA-bindende- und Q-Domäne enthalten, erfordert jede Isoform nur jeweils eine der beiden Domänen für seine Funktion bei der Gedächtnisbildung. Im Besonderen ist die Q-Domäne nur für Orb2A essentiell, wohingegen Orb2B die RNA-bindende Domäne benötigt. Darüber hinaus erwies sich Orb2A auch ohne RNA-bindende Domäne in der Lage, ein Fehlen der Q-Domäne in Orb2B vollständig zu komplementieren, durch Protein-Komplexbildung, die von der Orb2A Q-Domäne abhängt. Auch bezüglich ihrer Gedächtnisfunktion unterscheiden sich Orb2A und Orb2B. Während des Erlernens wird Orb2A durch ein Dopamin-Signal in spezifischen Synapsen aktiviert, um sie für die Speicherung von Gedächtnisspuren zu markieren. Aktiviertes Orb2A rekrutiert Orb2B in einen Komplex, wo es nach der Stimulierung durch ein erneutes Dopamin-Signal die Proteintranslation an der Synapse reguliert, um Erinnerungen langfristig zu speichern.