MYB-Transkriptionsfaktoren in Pflanzenstress

Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-Kaskaden sind in eukaryotischen Organismen vorkommende Signalmodule, bestehend aus MAPK kinase kinase (MAPKKK), MAPKK und MAPK. Entwicklunsregulierte oder exogene Signale werden durch diese Kaskade-Komponenten über einen Phosphorelay-Mechanismus amplifiziert und durch Phosphorylierung von MAPK Substratproteinen weitergeleitet. Die Bedeutung von pflanzlichen MAPK- Kaskaden in der biotischen und abiotischen Stressantwort ist durch mehrere Studien an MAPK(KK)-defizienten Mutanten belegt worden. Dennoch sind die molekularen Mechanismen und Komponenten, über die stress-aktivierte MAPK-Kaskaden eine entsprechende Abwehr und Stressanpassung gewährleisten, weitgehend unbekannt. Vorarabeiten Wir haben kürzlich VIP1, ein bZIP-Protein, als Interaktionspartner der Arabidopsis thaliana MAPK MPK3 isoliert (Djamei, Pitzschke et al., 2007). Als Folge seiner Phosphorylierung durch MPK3, welches durch verschiedene biotische und abiotische Stresse aktiviert wird, wandert VIP1 aus dem Cytoplasma in den Kern. Ein von VIP1 gebundenes DNA element wurde isoliert und zwei stressregulierte Gene, kodierend für die nahe verwandten Transkriptionsfaktoren MYB44 und MYB77, als direkte Zielgene von VIP1 identifiziert. MYB44 war außerdem als Interaktionspartner der MPK3/MPK6-aktivierenden MAPKK MKK4 isoliert worden. Weiters wurde eine Phosphorylierung von MYB44 und MYB77 durch MPK3 und MPK6 beobachtet. Projekt Im geplanten Projekt soll die - offenbar über diverse Rückkopplungsmechanismen gesteuerte - Regulation von und durch MYB44/MYB77 in der MAPK-regulierten Stresssignalleitung untersucht werden. Anhand von Microarray-Studien von transgenen MYB44- bzw. MYB77-überexprimierenden Pflanzen, in denen eine rasche Akkumulation der MYB-Proteine im Zellkern induziert wird, sollen die direkt von MYB44/77 regulierten Gene identifiziert und potentielle MYB44/77-kontrollierte Prozesse abgeleitet werden. Die mögliche stress- und MAPK- abhängige Transkription von identifzierten putativen MYB44/77-Zielgenen wird mittels RT-PCR von Wildtyp- und MAPK-defizienten Pflanzen untersucht. Damit wird auch angestrebt, den Signalweg[StressMKK4MPK3/6VIP1MYB44/77"X"] zu fundieren und um eine weitere Komponente ("X") zu erweitern. Die MAPK-Phosphorylierungsstellen in MYB44/MYB77 sollen durch Massenspektrometrieanalyse (MS) MYB-überexprimierender Pflanzen kartiert werden. Mittels transienter Expression in transfizierten Protoplasten und transgenen Pflanzen wird untersucht werden, wie sich die Phosphorylierung auf die Lokalisation und Aktivität von MYB44/77 auswirkt. Die mögliche Rolle der MAPK- Phosphorylierung von MYB44/77 für die pflanzliche Stressantwort wird anhand von Stresstoleranztests transgener Pflanzen, welche an den MS-identifizierten Phosphorylierungsstellen mutierte MYB44/77-derivate überexprimieren, untersucht werden. Mittels "Yeast-Three-Hybrid"-Experimenten soll geklärt werden, ob MYB44/77 in einem ternären Komplex [MKK4-MPK3/6-MYB44/77] vorliegen. Weiters soll eine mögliche "Feedback"-Regulierung von MPK3/MPK6-Kinaseaktivitäten durch die MYB-Faktoren getestet werden.

Im Projekt wurden Pflanzenproteine analysiert, die für die Anpassung an Umweltstress, z.B. Trockenheit und Salzstress, wichtig sind. Stress aktiviert MPK3 binnen weniger Minuten. Aktiviertes MPK3 kann nun MYB44 modifizieren, welches daraufhin Stress-Anpassungs-Gene anschaltet. Pflanzen, in denen dieser Informationsfluss defekt ist, sind stressanfälliger. Stärkere Signalleitung dagegen erhöhte die Stresstoleranz.In allen lebenden Organismen entscheiden sog. Transkriptionsfaktoren, welche Gene wann und wo an- bzw. abgeschaltet sind. Wären alle Gene in allen Zellen gleichsam aktiv, gäbe es keine gesonderten Organe wie etwa Wurzeln und Blätter. Dasselbe gilt für Menschen: Unsere Nieren- und Hautzellen enthalten dieselbe DNA, nur sind die einzelnen Gene unterschiedlich stark aktiv.Tiere und Pflanzen reagieren auf Signale von außen, indem sie die Aktivität einzelner Proteine ändern und relevante Gene an- oder abschalten. Stressantworten sind häufig nur effektiv, wenn sie schnell sind. Bei einem plötzlichen Kälteeinbruch zum Beispiel überleben Pflanzen nur, wenn sie ihre Schutzmechanismen prompt aktivieren können.In der Modellpflanze Arabidopsis (Ackerschmalwand) führt eine Vielzahl von Stressfaktoren binnen Minuten zur Aktivierung der kinase MPK3. Diese Aktivierung ist wichtig, um sich an Stress anzupassen. Z.B. steuert MPK3 das Schließen der Blattporen bei Trockenheit; oder die Produktion antibakterieller Substanzen nach Schädlingsbefall. MPK3 ist eine Kinase, kein Transkriptionsfaktor. Wie kann es dennoch Gene an- und abschalten?Wir haben den Transkriptionsfaktor MYB44 identifiziert, der direkt durch MPK3 kontrolliert wird. Stress-aktivierte MPK3 überträgt einen Phosphatrest auf MYB44. MYB44 kann daraufhin Gene anschalten und damit zur Stressanpassung beitragen. Der Phosphattransfer ist sehr spezifisch; MPK3 ändert nur eine von fünf möglichen Positionen in MYB44. Wird diese Position blockiert, funktioniert MYB44 nicht mehr.Im Labor lassen sich die Auswirkungen des Klimawandels auf Pflanzen nachbilden. Trockenheit und Hitze sind die Hauptursachen für die zunehmende Wüstenbildung und Bodenversalzung. Pflanzen, denen MPK3 oder MYB44 fehlt, sind extreme empfindlich gegenüber Salzstress. Reziprok sind Pflanzen, die vermehrt MYB44 bilden, toleranter. Jedoch nur, wenn der Phosphattransfer nicht blockiert wird. MYB44 und MPK3 sind direkte Interaktionspartner. Sie bilden Komplexe im Zellkern; also dort, wo Gene reguliert werden. Pflanzen, bei denen MYB44 nicht als Gen-anschalter sondern als Gen-abschalter vorliegt (durch Anhängen eines kleinen Peptids), können auf Salz- und Trockenstress nicht angemessen reagieren.