Synthese von RNA-Peptidkonjugaten - acylierte tRNA-Mimetica

Die ribosomale Translation kurzer Peptide kann zur Makrolidantibiotika-Resistenz z.B. gegen Erythromycin führen. Antibiotika dieser Klasse binden am Ribosom im sogenannten Peptidyl-Transferase-Zentrum (PTC), dort wo die eigentliche Peptidbindungsknüpfung katalysisiert wird und wo sich auch der Eingang zum ribosomalen Peptidaustrittstunnel befindet. Es ist bekannt, dass die Aminosäuresequenz und die Grösse des Resistenzpeptids ausschlaggebend für seine Aktivität sind. Darüberhinaus existiert eine Korrelation zwischen Peptidsequenz und strukturell unterschiedlichen Makrolidantibiotika, was eine spezifische Interaktion zwischen Peptid, Antibiotikum und Ribosom nahelegt. Da die Peptide alleine keine Resistenz bewirken, kann ein mechanistisches Szenario postuliert werden, bei dem die Translation dieser Peptide ein Verdrängen und Freisetzen der jeweiligen Macolidantibiotika bedingt. In diesem Kontext hat das vorliegende bioorganische, chemisch-synthetische Projekt zwei Hauptziele: 1) Die Entwicklung einer Synthesestrategie, die den effizienten Zugang zu nicht-hydrolisierbaren RNA-Peptide- Konjugaten garantiert. Diese sollen konstitutionell Mimetica von aminoacylierter tRNA darstellen. Ihre Verfügbarkeit ohne Einschränkung auf die Sequenz stellt bis dato ein erhebliches Hindernis im Hinblick auf die Untersuchung des oben dargelegten Phänomens dar. 2) Die Aufklärung der molekularen Mechanismen von Makrolidantibiotika-Resistenz und ribosomalen "Stallings" (Anhalten) mittels chemischer und biochemischer Methoden und - als langfristiges Ziel - durch Charakterisierung der Antibiotikum/Peptid/Ribosom Interaktion mittels Röntgenstrukturanalyse, basierend auf den synthetisierten Konjugaten. Ad 1) Wir beabsichtigen die Ausarbeitung einer Synthesestrategie zur Darstellung von Oligoribonucleotiden, die über ein 3`-terminales 3`-Amino-3`-deoxyadenosine an den C-Terminus eines Peptids beliebiger Sequenz durch eine nicht hydrolisierbare Amidbindung geknüpft sind. Dabei soll die Synthese des Oligos als auch die des Peptids am selben zu entwickelnden funktionalisierten Festphasenträger ablaufen. Die synthetische Herausforderung besteht im Schutzgruppenkonzept, welches mit der RNA- und Peptid-synthese vereinbar ist und gleichzeitig Flexibilität bezüglich der Peptidseitenketten-konstitution zulässt. Die Sequenzen unserer Konjugate leiten sich von Makrolidantibiotica-resistenz- und "Stalling"-Peptiden ab, während sich der Nucleinsäureteil vom CCA-Terminus bzw. der Vollängen-tRNA ableitet. Ad 2) Sobald die Synthese der Konjugate zufriedenstellend ausgearbeitet ist, werden wir die Bindung dieser Substrate an das ribosomale PTC (durch "Probing"-Experimente) verifizieren und im Anschluß zur chemischen und biochemischen Charakterisierung der Makrolidresistenz übergehen, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen aufzuklären. Dieser Teil des Projekts wird in Kollaboration mit N. Polacek (Medizinische Universität Innsbruck) und D.N. Wilson (Gene Center, LMU, Munich) stattfinden.

Das Ziel des Projekts war die Schaffung effizienter Synthesewege zu Peptid-RNA-Konjugaten. Diese sollen in ihrer Struktur mit Aminosäuren oder Peptiden beladenen tRNAs gleichen und Mimetica ihrer Funktion am Ribosom der Proteinfabrik der Zellen darstellen. Derartige Verbindungen werden insbesondere für strukturbiologische und molekularbiologische Studien ribosomaler Komplexe benötigt. Als das Projekt im Jahr 2010 begonnen wurde, gab es in der Literatur nur sehr wenige Berichte zur Synthese dieser speziellen Verbindungsklasse. Die hohe Nachfrage bestärkte uns in dem Unterfangen effiziente synthetische Zugänge zu kreieren. Um dieses Ziel zu erreichen mussten die folgenden Hürden adressiert und erfolgreich überwunden werden: i) Zugang zu einem breiten Spektrum an Festphasenträgern für die Festphasensynthese von Peptid-RNA-Konjugaten. ii) Entwicklung flexibler Synthesewege für hydrolysestabile Peptid-tRNA-Mimetica, die darüber hinaus moderne Biokonjugationsreaktionen wir Click- oder Staudinger-Ligation zur weiteren Funktionalisierung erlauben. iii) Entwicklung eines synthetischen Zugangs zu Volllängen-tRNA-Konjugaten (mit hydrolysestabiler Verknüpfung), welcher die natürlichen, überwiegend sehr komplexen Nukleosidmodifikationen miteinbezieht. iv) Schaffung eines synthetischen Zugangs, der auf der Nativen Chemischen Ligation von Peptiden beruht um eine größtmögliche Flexibilität im Hinblick auf die Peptidsequenz zu gewährleisten. v) Erweiterung der oben angeführten Synthesezugänge für die Implementierung von posttranslationalen Modifikationen, wie Methylierungen und Phosphorylierungen.Das Projekt trug daher unmittelbar und signifikant dazu bei, flexible Synthesewege zu Peptidyl-tRNA-Mimetica für umfassende strukturelle und funktionelle Studien von ribosomalen Komplexen zu generieren. Im Speziellen profitieren strukturbiologische Ansätze zur Aufklärung der Funktion und Regulation der ribosomalen Proteinbiosynthese eine Rolle. Die im Rahmen des Projekts synthetisierten Verbindungen stellen die Schlüsselverbindungen in einer laufenden internationalen Kooperation (Prof. Alexander Mankin, University of Illinois at Chicago) zur Aufklärung der molekularen Mechanismen von Makrolidantibiotika und dem assoziierten ribosomalen Halten dar.