Physiologie und Lokalisierung von Pollen-Ionentransportern

Pollenkörner, die auf einem entsprechenden Stigma landen, beginnen zu keimen und es wächst ein Pollenschlauch aus, der die Gameten zur anschließenden Befruchtung durch das Stigmagewebe zur Eianlage transportiert. Aufgrund ihres einfachen Aufbaus dient der Pollen als Modellsystem zur Erforschung des Spitzenwachstums. Wachsende Pollenschläuche bauen um sich herum ein elektrisches Feld auf, dessen typisches Muster durch den Ein- und Ausstrom von K+ , H+ , Cl - und Ca2+ aufrechterhalten wird. Diese lokale Anordnung der Ionenströme entlang des wachsenden Pollenschlauches wird wahrscheinlich durch eine heterogene Verteilung von Ionenkanälen, -carriern und -pumpen in der Plasmamembran bewirkt, wobei die molekulare Identität der einzelnen Ionentransporter noch nicht geklärt ist. Ein detailliertes Bild des endogenen, elektrischen Feldes wurde hauptsächlich durch Untersuchungen an Lilienpollen gewonnen, die aber für molekular-biologische Untersuchungen im Gegensatz zu Arabidopsis Pollen eher ungeeignet erschienen. In den letzten Jahren ist es im Labor des Antragstellers gelungen die Sequenzen von K+ Kanälen und H+ ATPasen aus Lilienpollen zu identifizieren. Durch die Untersuchungen im Rahmen dieses Projektes ist geplant, 1. die Transporteigenschaften der identifizierten Ionentransporter in einem heterologen Expressionssystem (Hefezellen, Xenopus Oozyten) mit elektrophysiologischen (patch-clamp) zu charakterisieren, 2. die in Hefezellen exprimierten Transporter mit Hilfe fluoreszierender Marker (=tags: GFP, FlAsH) zu lokalisieren und ihren turn-over in der Plasmamembran zu beobachten, 3. die Fluoreszenz-markierten Ionentransporter in Pollen zu exprimieren und zu lokalisieren und 4. die Auswirkung von gentechnisch-veränderten Transportproteinen auf die Pollenphysiologie zu untersuchen. Im heterologen Expressionssystem soll aufgeklärt werden, ob die hier gemessenen Transporteigenschaften der Kanäle und Pumpen mit den Eigenschaften der in-vivo gemessenen Ionenströme (patch-clamp) und denen des elektrischen Feldes korrelieren und inwieweit die Fluoreszenzmarkierung die Transportaktivität beeinflusst. In weiterer Folge des Projektes werden die identifizierten Ionentransporter in Expressionsvektoren umkloniert, die eine transiente oder auch stabile Expression in Lilienpollen ermöglichen. Mittels Partikelbombardments können Lilienpollen transient transformiert werden und die Lokalisierung der entsprechenden Transporter::Fluoreszenz-Tag Proteine untersucht werden. Stabil transformierte Lilienpflanzen werden aus undifferenzierten Kalli regeneriert. Dazu wird vorher die Regeneration und Transformation von Lilienpflanzen untersucht und ein Protokoll entwickelt, dass eine verlässliche Regeneration der transgenen Lilienpflanzen aus Kalli ermöglicht. Dieser Aspekt des Projektes ermöglicht nicht nur Untersuchungen zur Physiologie des Pollenschlauchwachstums (gleichzeitige Messung der Aktivität und der Lokalisation der Ionentransporter, Effekt gentechnisch-veränderter Ionentransporter), sondern die erfolgreiche Transformation und Regeneration von Lilien ist auch ein wichtiger Schritt in den angewandten Gartenbauwissenschaften (ornamental horticulture`).

Dieses Projekt befasst sich mit den Grundlagen, die zur Entstehung des elektrischen Feldes um den wachsenden Pollenschlauch beitragen: die Funktion und die Lokalisierung zweier Hauptkomponenten, der Plasmamembran H+ ATPase und des K+ Kanals. Beide Ionentransporter wurden in Lilienpollen, einem physiologischen Modellsystem für das Pollenschlauchwachstum, identifiziert und sequenziert, sowie ihre Funktion beim polaren Schlauchwachstum erforscht.Eine erfolgreiche Befruchtung bei Pflanzen ist die essentielle Voraussetzung für die Produktion von Früchten und Samen, also der Nahrung für eine wachsende Weltbevölkerung. Dazu transportieren Pollenkörner die männlichen Spermien zur weiblichen Eianlage. Dies geschieht durch einen Pollenschlauch, der vom Pollenkorn gebildet wird, nachdem es auf die Narbe gefallen ist. Der Pollenschlauch wächst durch das Griffelgewebe zur Eizelle und entlässt dort die Spermien für die Befruchtung. Dabei wird der Pollenschlauch von einer Art Navigationssystem geleitet, das ihm die Richtung zur Eizelle angibt. Dieses Navigationssystem besteht aus einem Ca2+-Gradienten in der Schlauchspitze und aus einer bestimmten Anordnung von Ionentransportern in der Plasmamembran der Schlauchzelle, die ein elektrisches Strommuster bzw. ein elektrisches Feld, generieren, an dem sich der Pollenschlauch bezüglich seiner Wachstumsrichtung orientieren kann. Können Pollenschläuche durch Fehler im Navigationssystem die Eizellen nicht finden, dann schlägt die Befruchtung fehl, was sich direkt auf die Ernteertrag auswirkt. Für die PM H+ ATPase konnte gezeigt werden, dass sie eine wichtige Rolle bei der Osmoregulation besitzt und bei der Regulation des Turgordrucks verantwortlich ist. Dadurch ist es dem Pollenschlauch möglich unter unterschiedlichen osmotischen Bedingungen weiter zur Eizelle zu wachsen ohne zu platzen. Die für die Regulation der PM H+ ATPase zuständigen 14-3-3 Proteine konnten auch im Pollen isoliert und sequenziert werden. Mit Hilfe von rekombinant hergestellten 14-3-3 Proteinen und einer regulatorischen Domäne der PM H+ ATPase werden zurzeit die molekularen Details der Regulation aufgeklärt.Der K+ Kanal (LilKT1) konnte im Lilienpollenschlauch überraschenderweise nicht in der Plasmamembran lokalisiert werden. Dieses Phänomen wurde in einem Hefe- und einem Pflanzen-Expressionssystem genauer untersucht und es zeigte sich, dass dieser Kanal nur in dem pflanzlichen Expressionssystem teilweise in der Plasmamembran zu finden ist. Welche Rolle dieser Kanal jetzt beim Schlauchwachstum spielt, konnte nicht einwandfrei geklärt werden.