Neue Targets einer pilzspezifischen Proteinmethyltransferase

Zelluläre Proteine können nach ihrer Synthese z.B. durch Acetylierung, Phosphorylierung oder Methylierung posttranslational modifiziert werden. Die Protein-Methylierung erfolgt an Arginin-, Lysin-, Histidin-, Prolin- und Carboxylresten von Aminosäuren. Die Arginin-Methylierung wird von Mitgliedern der Protein-Arginin- Methyltransferase (PRMT) Familie katalysiert und ist an der Regulation zahlreicher biologischer Prozesse wie RNA-Prozessierung, Transkription, Reparatur von DNA-Schäden sowie bei der Signaltransduktion und bei Differenzierungsvorgängen beteiligt. Unser Labor konnte zeigen, dass in Aspergillus nidulans drei verschiedene PRMTs exprimiert werden, die sowohl in vitro, als auch in vivo über Methyltransferase-Aktivität verfügen. Zwei dieser Proteine (RmtA, RmtC) zeigen Sequenzhomologien zu den humanen Proteinen PRMT1 bzw. PRMT5. Das dritte Protein (RmtB) hingegen nimmt aufgrund seiner besonderen enzymatischen und strukturellen Eigenschaften eine Sonderstellung ein. Analysen der Substratspezifität der Aspergillus PRMTs haben weiters gezeigt, dass diese Proteine eine Reihe unbekannter Proteine in vitro methylieren können. Unser langfristiges Ziel ist es, die biologische Funktion der pilzspezifischen Arginin-Methyltransferase RmtB aufzuklären. In einem ersten Schritt konnten wir hierfür mehrere PRMTs isolieren und charakterisieren und die entsprechenden Deletionsmutanten herstellen. Diese Mutanten stellen nun ein wichtiges Hilfsmittel für die Identifikation neuer Substrate der Aspergillus PRMTs, im Speziellen des RmtB Enzyms dar. Potentielle Substrate der PRMTs werden zunächst in Aspergillus Wildtyp bzw. rmtB-Mutantenstämmen mittels radioaktiv markiertem S-Adenosyl-Methionin in vitro nachgewiesen, wodurch eine Unterscheidung von selektiven und nichtselektiven Substraten möglich sein sollte. Die Proteine werden sodann mittels zweidimensionaler Gelektrophorese aufgetrennt und anschliessend im Massenspektrometer analysiert. Die Verwendung von Peptidantikörpern und/oder der Einsatz eines in vivo Methylierungsassays soll zeigen, ob die identifizierten Proteine auch in vivo Substrate des RmtB Proteins darstellen. Die Identifikation neuer Substrate wird die Grundlage für die weitere, langfristige Analyse der biologischen Funktion dieser Modifikation in Aspergillus schaffen. Es wird möglich sein, die Auswirkungen von spezifischen Deletionsmutanten sowohl auf phänotypische Veränderungen des Pilzes, als auch auf die globale Genexpression zu untersuchen. Die Identifikation betroffener Gene sollte Hinweise über mögliche zusätzliche regulatorische Mechanismen der Protein Methylierung bringen. Im Besonderen wird auch der Frage nachgegangen, welche Rolle PRMTs für die Regulation des Sekundärmetabolismus in A. nidulans spielen. Solche Sekundärmetabolite entfalten für den Menschen sowohl positive Wirkungen (z.B. Antibiotika), zeigen aber auch unerwünschte toxische Eigenschaften (z.B. Aflatoxin).

Zentrales Ziel dieser Arbeit war es, neue Hinweise über die Funktion der Protein-Arginin- Methylierung im filamentösen Pilz Aspergillus nidulans zu erhalten. Die Protein-Methylierung spielt unter anderem in der Genregulation eine wichtige Rolle, über die Bedeutung dieser Modifikation bei filamentösen Pilzen ist aber sehr wenig bekannt. Filamentöse Pilze sind sowohl für die Biotechnologie (z.B. Antibiotikaproduktion), als auch für medizinische Anwendungen (Aflatoxine, Aspergillome) interessante und wichtige Modellorganismen. Folglich können eventuell Erkenntnisse, die aus Untersuchungen von z.B. epigenetischen Modifikationen gewonnen werden, in den genannten Bereichen Anwendung finden. Mit Hilfe einer Proteomanalyse konnten wir zunächst mehrere Zielproteine von Protein-Arginin- Methyltransferasen (PRMT) in Aspergillus isolieren und identifizieren, einschließlich dem VipC Protein, das Sequenzhomologie zu einem Regulator des Sekundärmetabolismus (LaeA) hat und dem ArtB, einem 14-3-3 homologen Protein. 14-3-3 Proteine sind multifunktionelle Regulatoren zellulärer Signalprozesse. Ein wesentliches Ziel war es nun, die in vivo Eigenschaften der identifizierten Proteine zu analysieren, was eine wichtige Grundlage für weitere funktionelle Studien darstellt. In diesem Zusammenhang gelang es uns beide Proteine, versehen mit einer Markierung (TAG), in Aspergillus zu exprimieren. Die anschließende biochemische Reinigung und eine Analyse mittels Massenspektrometrie (MS) identifizierten mehrere Methylierungsstellen an Arginin-Resten. Diesen in vivo Befund konnten wir mit weiteren biochemischen Analysen, wie der Isolierung des endogenen Proteins und der nachfolgenden Analyse mittels MS erfolgreich bestätigen. Diese Ergebnisse sollten weiters durch die Charakterisierung der rekombinant hergestellten Proteine ergänzt werden. Leider konnte weder VipC, noch ArtB mit Hilfe von isolierten PRMT Enzymquellen in vitro methyliert werden. Ursache für diesen überraschenden Befund könnte sein, dass entweder Modifikationen, die für eine effiziente Methylierung notwendig sind in den rekombinanten Proteinen fehlen und/oder (fehlende) Interaktionspartner für eine korrekte Erkennung bzw. Modifikation der Substrate Voraussetzung sind. Die isolierten Substrate werden nun dazu verwendet, polyklonale Antikörper für die Bestimmung der subzellulären Lokalisation herzustellen, und interagierende Proteine zu identifizieren. Die weitere Charakterisierung der Substrate soll die Grundlage für die langfristige Analyse der biologischen Funktion dieser Modifikation in Aspergillus schaffen. Finales Ziel ist es, einen möglichen Zusammenhang zwischen der Proteinmethylierung und der Regulation des Sekundärmetabolismus (VipC) einerseits und der Regulation/Koordination von Proteininteraktionen distinkter zellulärer Prozesse (ArtB) andererseits in Aspergillus nidulans aufzuklären.