Neue Biokatalytische Methode zur C-C Bindungsknüpfung

Organische Reaktionen zur C-C Bindungsknüpfung stellen das Herzstück der organischen Chemie dar, um das Kohlenstoffgrundgerüst der organische Verbindungen aufzubauen. Überraschenderweise, gibt es nur eine sehr geringe Anzahl von enzymatischen C-C Knüpfungsreaktionen, die in der Organischen Chemie Anwendung finden. Das Enzyme BBE (berberine bridge enzyme) katalysiert die Bildung einer äußerst bemerkenswerten intra- molekularen C-C Bindung. Für diese enzymatische Umsetzung gibt es bis jetzt noch kein vergleichbares organisch- chemisches Äquivalent. Das einzige Reagenz, welches für die Aktivierung benötigt wird, ist molekularer Sauerstoff. Seit wenigen Monaten ist es nun möglich dieses Enzym in ausreichenden Mengen herzustellen, was nun eine intensive Untersuchung des Substratspektrums und des Mechanismus der Reaktion ermöglicht. Eine Optimierung der Reaktionsbedingungen (O2 -Druck, Katalase, Licht) wird eine Durchführung von präparativen Reaktionen mit diesem außergewöhnlichen Enzym ermöglichen. Eine Änderung des Substitutionsmusters von N- Methyl zu N-Ethyl wird eine mögliche chirale Induktion an einem neuen Kohlenstoff-Zentrum aufklären. Schließlich soll untersucht werden, inwieweit anstatt der intra-molekularen eine inter-molekulare C-C Bindungsknüpfung möglich ist. Als Beispiel dient hier eine Knüpfung zwischen N-Methyl isoquinolin mit Phenol Derivaten. Hinweise für einen modifizierten Mechanismus werden aus Struktur-Funktions-Studien erhalten. Dieses Projekt könnte neue Möglichkeiten aufzeigen, um enzymatische Umsetzungen in der organischen Synthese auszunutzen. Speziell die Anwendung von molekularem Sauerstoff als Aktivierungsreagenz zeigt welche unglaublich interessanten Möglichkeiten die Natur für Reaktionen besitzt, für die es bis jetzt in der Chemie keine vergleichbaren Reaktionen gibt.

Das Ziel dieses Projektes war die Synthese von Isochinolin-Alkaloiden unter Zuhilfenahme eines Enzyms, dem Berberine Bridge Enzym aus kalifornischem Goldmohn. Isochinolin-Alkaloide sind Substanzen, die in der Natur - hauptsächlich in Pflanzen - weit verbreitet sind und mannigfaltige Anwendungen in der Medizin finden. Die Isolierung dieser Substanzen aus Pflanzen gestaltet sich schwierig, da große Mengen an Rohmaterial gebraucht werden, jedoch die Ausbeuten an reiner isolierter Substanz nur sehr gering sind. Auch die chemischen Synthesen sind aufwendig und komplex. Viele Reaktionsschritte sind notwendig und die Ausbeuten sind gering, so dass die rein chemische Synthese ökonomisch und ökologisch nicht erstrebenswert ist. Das hier verwendete Enzym wurde aus Mohn isoliert und ist in der Lage eine chemisch einzigartige Reaktion durchzuführen: Es katalysiert die Bildung einer neuen Verknüpfung (Bindung) zwischen zwei Kohlenstoffatomen; das einzige Reagenz, das dafür notwenig ist, ist molekularer Sauerstoff. Es konnte im Projekt gezeigt werden, dass das Enzym neben seinem natürlichen Substrat auch verschiedene nicht natürliche Substrate umsetzt und so einen Zugang zu neuen Isochinolin-Derivaten ermöglicht. Um die Eigenschaften des Enzyms genauer zu studieren, wurden die Reaktionsbedingungen optimiert. Hier wurden zum Beispiel die optimale Reaktionstemperatur, das pH-Optimum und die Auswirkung von organischen Co-Lösungsmitteln bestimmt. Tests mit verschiedenen organischen Co- Lösungsmitteln zeigten, dass das Enzym erstaunlich stabil ist; Pflanzenenzyme zeigen häufig eine geringe Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln. Das von uns untersuchte Enzyme zeigte jedoch sogar bei höheren Konzentrationen an Lösungsmittel (70% v/v Toluol) volle Aktivität. Selbst bei einer Konzentration von 99.4% v/v an Toluol konnte immer noch eine gute Aktivität beobachtet werden. Diese Stabilität ermöglichte die Verwendung von Toluol zum Lösen von größeren Mengen an Substrat, so dass die Substrate bei einer Konzentration von 20 g/L erfolgreich umgesetzt werden konnten. Das Enzym arbeitet enantioselektiv; das heißt, dass nur das (S)-Enantiomer zum entsprechenden Produkt umgesetzt wurde. Dies ermöglicht die Isolierung des (S)-Produkts und des verbleibenden (R)-Substrates; beides sind interessante Verbindungen. Weiters wurden 10 nicht natürliche Substrate synthetisiert, um das Substratspektrum des Enzyms zu testen. Die vier besten Substrate wurden im 500 mg Maßstab erfolgreich umgesetzt. Die Produkte und Substrate wurden mit verschiedenen analytischen Methoden genau charakterisiert (HPLC, GC, GC-MS, HR-MS, NMR).