Morphogene Proteine und Organell Homeostase

Das vorliegende Projekt zielt auf ein besseres Verständnis des dynamischen Prozesses der Membran-proliferation in biologischen Systemen ab. Membran-umhüllte Strukturen sind die Voraussetzung für die intrazelluläre Kompartimentierung. Diese essentiellen Strukturen sind ein Merkmal eukaryotischer Zellen und müssen unter allen Bedingungen erhalten bleiben. Sie leisten wesentliche Beiträge zum Metabolismus und zum Schutz vor lebensbedrohenden Umweltbedingungen. Aus diesem Grund führen intra- und extrazelluläre Veränderungen auch zu einer Neuorganisation des Endomembransystems. Diese Neuordnung muß im Einklang mit den jeweiligen Aufgaben der Membranstrukturen und den neuen Bedingungen stehen und unterliegt daher einer genauen Regulation und Kontrolle. Defekte in der Funktion von Organellen sind oft die Ursache von schweren Krankheiten. Eine Voraussetzung für das Verständnis der biologischen Funktion von Membranproteinen ist das Wissen um Ihre Wechselwirkungspartner und um ihre genaue Topologie in vivo. Im vorliegenden Projekt soll daher die makromolekulare Architektur eines Proteinsystems analysiert werden, welches an der Regulation der Membranproliferation beteiligt ist. Die wichtigste Rolle der Peroxisomen ist ihr Beitrag zum Lipid-metabolismus einer Zelle. Darüberhinaus spielen die Peroxisomen eine Rolle beim oxidativen Stress, weil in den Peroxisomen Wasserstoff-peroxid und andere reaktive Sauerstoff-produkte entstehen und abgebaut werden können, weshalb Peroxisomen auch mit dem Prozess des Alterns in Verbindung gebracht werden. Trotzdem ist noch wenig über den Mechanismus der Proliferation dieser Organellen bekannt. Von den 32 bekannten Peroxinen, die an der Biogenese der Peroxisomen beteiligt sind, konnte nur wenigen eine Rolle bei der Membranproliferation zugeschrieben werden. Darunter befindet sich die Famile der Pex23-proteine, die als negative Regulatoren von Zahl und Größe der Peroxisomen angesehen werden. Wir konnten bereits zeigen, daß ein Mitglied der Pex23-protein Familie, das Peroxin 30, mit dem Protein Yop1 und Retikulon-proteinen gemeinsam auftreten kann. Diese als morphogenische Proteine bekannten Faktoren wiederum sind notwendig, um das tubuläre endoplasmatische Retikulum (ER) auszubilden und zu erhalten, was auf einen Zusammenhang zwischen dem peroxisomalen Endomembransystem und Bereichen des ER hinweist. Im vorliegenden Projekt werden wir die Verbindung zwischen Teilen des ER und der Proliferation des peroxisomalen Endomembransystems beweisen, indem wir die zeitlichen und räumlichen dynamischen Veränderungen der morphogenischen Proteine in Hefe und in menschlichen Zellen analysieren. Wir werden Wechselwirkungspartner analysieren, die Funktionen gemeinsamer Strukturmotive feststellen und die Komponenten von Proteinkomplexen mittels Massenspektrometrie identifizieren. Um die Funktion der morphogenischen Proteine bei der Peroxisomenproliferation zu bestimmen, werden wir mit biochemischen und mit "live-cell imaging" Techniken die dynamischen Veränderungen studieren, wenn die Zellen optimalen Wachstumsbedingungen oder oxidativem Stress ausgesetzt sind. Die Ergebnisse unserer Arbeiten werden zu einem besseren Verständnis dafür führen, wie sich das intrazelluläre Endomembransystem unter verschiedenen Bedingungen verhält und wie verletzlich dieses System oxidativem Stress gegenüber ist. Damit können wir auch feststellen, welche Rolle die morphogenischen Proteine bei der Organellenproliferation spielen, und wie Organellen entstehen und ihre Rolle in den Zellen wahrnehmen.

Eukaryotische Zellen sind in spezialisierte Kompartimente unterteilt, die Organellen genannt werden. In Bezug auf Fettmetabolismus sind hier sind besonders Peroxisomen von großer Bedeutung. Im Menschen führen Mutationen in PEX Genen zu Defekten in der Funktion oder Bildung von Peroxisomen. PEX Gene kodieren für Proteine, Peroxine, die für den Aufbau und die Bildung von Peroxisomen notwendig sind und Mutationen derselben stehen mit ernsten neurologischen Krankheiten in Verbindung. Peroxisomen werden durch i) Duplikation via Wachstum/Teilung mithilfe von Proteinen der PEX11 Familie und Teilungsfaktoren, die auch in Mitochondrien verwendet werden und ii) durch Knospung vom endoplasmatischen Retikulum (ER) gebildet. In diesem Projekt wurde der molekulare Mechanismus, der der Erhaltung von Peroxisomen in Hefen und Menschen zugrunde liegt, untersucht. Wir wendeten eine duale Herangehensweise an, die auf quantitativer Proteomik und live-imaging basiert, um jene molekularen Netzwerke zu analysieren, die an der Regulation der Peroxisomenbildung beteiligt sind. Die Ergebnisse unserer Studie in der Hefe Saccharomyces cerevisiae zeigen eine direkte Rolle des peroxisomalen Vermehrungsfaktors Pex30p in der Etablierung von ER-zu-Peroxisomen Assoziationen auf. Zusätzlich weisen unsere Daten darauf hin, dass ER residente Proteine der Reticulon Familie, Rtn1p, Rtn2p und Yop1p an der Regulierung der Peroxisomenbildung beteiligt sein könnten. Pex30p scheint die Peroxisomenvermehrung zu koordinieren, indem es die Verankerung von Peroxisomen an der ER Membrane vermittelt. Zusätzlich haben wir ein humanes Ortholog des Hefe Pex30p charakterisiert. In funktionellen Tests, um die molekularen Details der Peroxisomenvermehrung in lebenden Zellen zu studieren, konnten wir demonstrieren, dass die PEX11 Proteine aus Säugetieren als Membranelongationsfaktoren fungieren. Analysen mutierter PEX11 Proteine zeigten, dass im Zuge der Peroxisomenduplikation das neu gebildete Peroxisom frisches Proteinmaterial benötigt, während der Matrixinhalt des Mutterorganelles zurückgehalten wird. Dieser Mechanismus könnte zu einer Verjüngung der Peroxisomen in der Zelle führen. Unsere Studien demonstrierten weiters eine Funktion der PEX11 Proteine in der Peroxisomenpolarisation und in der Membranausstülpung. Die Teilung von Organellen benötigt Membranumformungen, um die Assemblierung der Teilungsmaschinerie zu ermöglichen und zu erleichtern. Unsere Daten liefern Beweise, dass mitochondrielle Teilungsfaktoren mithilfe der Aktion der PEX11 Proteine im Rahmen der Peroxisomenelongation zur Peroxisomenmembrane rekrutiert werden. Dies führt schlussendlich zur Einschnürung und Teilung des Organells. Unsere Studien in Hefen, Pflanzen und menschlichen Zellen etablierten die evolutionäre Konservierung der peroxisomalen Teilungsmaschinerie.