Paenibacillus Glycoengineering & Nanobiotechnologie

Nanobiotechnologie ist eine sich in rascher Entwicklung begriffene Wissenschaftsdisziplin, die die gezielten Manipulationen im Grössenbereich von 1 bis 100 nm einschliesst und interessante Anwendungsmöglichkeiten im Bereich der Natur- und Materialwissenschaften bietet. Häufig werden dabei Ausgangsmaterialien verwendet, die die Fähigkeit zur spontanen Selbst-Organisation besitzen, um supramolekulare Strukturen in einem "bottom-up" Prozess auszubilden. In diesem Zusammenhang spielen bakterielle Zelloberflächenschichten (S-Schichten) als biologisches, molekulares Steckbrett eine bedeutende Rolle. Chemische Analysen von verschiedenen S- Schichtproteinen haben das Vokommen von kovalent-gebundenen Zuckerresten in ausgewählten Stämmen bestätigt. Da in Glykoproteinen die Zuckerreste of für deren biologische Funktion verantwortlich sind, können nanoskalige, glykosylierte S-Schichtproteine interessante Anwendungen im Bereich der Nanobiotechnologie ermöglichen. Paenibacillus alvei CCM 2051T wurde aus den bekannten Mikroorganismen mit glykosylierten S-Schichtproteinen ausgewählt, da mit diesem Organismus auch genetische Manipulationen, d.h. Transformationen und damit Veränderungen der Glykanstrukturen prinzipiell möglich sind. Um unser Langzeit-Ziel, nämlich die Modifikation von glykosylierten S-Schichtproteinen durch "Carbohydrate Engineering" zu erreichen, soll im beantragten Projekt das natürlich vorkommende "nonsens" S-Schichtglykoprotein von P. alvei CCM 2051T in eine "intelligente" S- Schichtglykanstruktur übergeführt werden. Weiters soll ein System etabliert werden welches (i) die endotoxin-freie Produktion von Glykanen für ein in vivo "surface display" ermöglicht und (ii) ein effizientes S- Schichtneoglykoprotein-Sekretionssystem darstellt. In einer "proof of concept"-Studie soll durch den Austausch der slg Gencluster von P. alvei CCM 2051T und Geobacillus stearothermophilus NRS 2004/3a das in vivo "surface display" experimentell bestätigt werden. Für die Etablierung des S-Schichtneoglykoprotein-Sekretionssystems ist die genetische Modifikation des sekundären Zellwandpolysacchrids (SCWP) von großer Bedeutung, da das SCWP für die Verankerung der S-Schicht an der Zellwand verantwortlich ist. Durch Ausschalten der an der Biosynthese des SCWP beteiligten Gene soll die Sekretion des S-Schichtneoglykoproteins in des Kulturmedium ermöglicht werden, von wo es relativ einfach isoliert und gereinigt werden kann. Das geplante Projekt dient der Etablierung von P. alvei als Wirtsorganismus für in vivo "surface display" und der Herstellung und Sekretion von rational geplanten S-Schichtneoglykoproteinen für potentielle Anwendungen in Nanobiotechnologie und Biomedizin.

Die Ziele des kürzlich abgeschlossenen Forschungsprojekts P20745-B11 waren: Sequenzierung des Surface (S-)layer Gens spaA, des slg (surface layer glycosylation) und des SCWP (secondary cell wall polymer) Genclusters von Paenibacillus alvei CCM 2051. Proof of concept Studie zum Austausch von homologen Genen aus den slg Genclustern von P. alvei und Geobacillus stearothermophilus NRS 2004/3a. Knock-out von essentiellen Genen des SCWP Genclusters, um die Wechselwirkung zwischen SCWP und dem S-Schichtprotein zu unterbinden, was zur Abscheidung der S-Schicht in das Kulturmedium führen sollte.Zu Beginn des Projekts war das S-Schicht Glykosylierungssystem des thermophilen Bakteriums G. stearothermophilus NRS 2004/3a am besten untersucht, obwohl es in diesem Stamm Probleme bei der Aufnahme von Fremd-DNS gibt. Daher wurde nach erfolgreichen Experimenten mit mesophilen Bacillus-Stämmen P. alvei CCM 2051 für die Entwicklung eines Transformationssystems ausgewählt. Da die Adaptor-Oligosaccharide der S-Schichtglykane von P. alvei CCM 2051 und G. stearothermophilus NRS 2004/3a idente Strukturen aufweisen, wurden vergleichbare Enzymreaktionen bei der Glykanbiosynthese angenommen. Die Lipidcarrier-Transferase WsaP initiiert bei G. stearothermophilus NRS 2004/3a die S-Schichtglykosylierung. Aus diesem Grund wurde dessen Homologes WsfP von P. alvei als Ziel für das zu entwickelnde Gen-Knockout-System ausgewählt. Der Verlust der Genfunktion lieferte eine leicht überprüfbare Glykosylierungs-defiziente Mutante. Durch Komplementierung der Enzymaktivität von WsfP mit WsaP konnte die Funktion von WsfP in P. alvei einwandfrei nachgewiesen werden.Das Strukturgen spaA des S-Schichtproteins von P. alvei wurde sequenziert und für die Entwicklung eines in vivo Oberflächen-Co-display-Systems mit SpaA als Zellwand-Anker eingesetzt. Neben nativem SpaA wurden auch ein heterologes Peptidepitop und ein fluoreszierendes Protein präsentiert. Dies unterstreicht die generelle Eignung dieses Systems für zukünftige in vivo Oberflächen-Co-display-Anwendungen von interessanten Epitopen.Neben der Präsentation von funktionalisierten S-Schichten auf der Zelloberfläche kann auch deren Abscheidung in das Kulturmedium interessant sein, da so kosten- und zeitintensive Reinigungsschritte wegfallen. Daher wurde der Verankerungsmechanismus von SpaA von P. alvei mit drei N-terminalen SLH-Domänen im Detail untersucht. Diese Domänen spielen bei der kovalenten Verankerung von S-Schichtproteinen an die Zellwand des Bakteriums eine bedeutende Rolle und stellen einen wichtigen Ausgangspunkt für die geplante Präsentation von interessanten Zielstrukturen dar.