Massenspektrometrie von Drosophila Tumorsuppressoren

Während der letzten Jahre haben neue Erkenntnisse in der Stammzellbiologie unsere Ansichten darüber, wie ein Tumor entsteht, grundlegend verändert. Bisher dachte man, dass jede Zelle in einem Tumor das gleiche Potential hat, das Wachstum von Tumoren aufrecht zu erhalten bzw neue Tumore zu initiieren. Neuere Experimente deuten aber darauf hin, dass nur ein kleiner Anteil der Zellen das Tumorwachstum aufrechterhalten kann. Diese Zellen besitzen Stammzelleigenschaften und werden daher Tumorstammzellen genannt. Die Tumorstammzellhypothese ist möglicherweise nicht auf alle Tumore anwendbar, sie hat aber dennoch grosse Bedeutung fuer die Tumorbehandlung, da nur Therapien, die die Tumorstammzellen zerstören, erfolgreich sein können. Das Ziel dieses Projektantrags ist es, unter Verwendung der Fruchtfliege Drosophila melanogaster die molekularen Mechanismen zu erforschen, die die Proliferation von Stammzellen kontrollieren, und die Defekte zu beschreiben, die normale Stammzellen in solche Zellen verwandeln, die Tumore bilden können. Vor kurzem hat unsere Forschungsgruppe das Protein Brat als einen wichtigen Regulator für die Vermehrung von neuralen Stammzellen in Drosophila identifiziert. Während der Teilung von Stammzellen segregiert Brat asymmetrisch in nur in eine der zwei enstehenden Tochterzellen, wo es nach derzeitigem Wissen das Zellwachstum und die Vermehrung hemmt. In Brat Mutanten proliferieren alle Tochterzellen und behalten Stammzelleigenschaften, was zu einer exponentiellen Expansion der Stammzellpopulation und letztendlich zu neoplastischer Zellwucherung und zur Bildung von Stammzelltumoren führt. Brat ist auch im Menschen konserviert und seine Homologen sind in menschlichen Tumoren dereguliert, was daraufhin deutet, dass sie eine ähnliche Funktion in höheren Organismen spielen. Es ist aber nicht bekannt, durch welchen Mechanismus Brat die Zellvermehrung von Stammzellen kontrolliert. In diesem Antrag wollen wir Bindungspartner von Brat mit Hilfe von Immunpräzipitation und quantitativer Massenspektrometrie identifizieren. Da Brat ausserhalb des Nervensystems als Repressor der Proteintranslation wirkt, wollen wir in einem weiteren Versuchsansatz durch den quantitativen Vergleich des Proteoms von Wildtyp und Brat mutanten Zellen Proteine identifizieren, die entweder direkt oder indirekt von Brat reguliert werden. Dazu werden wir die Proteine differentiell mit stabilen Isotopen markieren und massenspektrometrisch identifizieren und quantifizieren. Die Experimente werden in enger Zusammenarbeit zwischen einer Drosophila und einer Massenspektrometrie Forschungsgruppe durchgeführt. Diese enge Zusammenarbeit ermöglicht die Etablierung von technisch anspruchsvollen chromatographischen und massenspektrometrischen Methoden und ihre Anwendung auf die beschriebene spezifische biologische Fragestellung. Die identifizierten Proteine werden mit Hilfe etablierter genetischer und zellbiologischer Drosophila Methoden funktionell charakterisieren. Wir werden sowohl transgene Fliegen generieren, die diese Gene überexprimieren, als auch durch transgene RNAi die Expression der Proteine unterdrücken. Dafür steht uns eine Kollektion induzierbarer RNAi Linien zur Verfügung, die die funktionale Analyse einer grossen Anzahl von Genen in sowohl im Wildtyp- als auch im Brat mutanten Hintergrund erlaubt. Diese Experimente sollen neue Aufschlüsse über die molekularen Mechanismen geben, durch die Brat die Proliferation von Drosophila Neuroblasten kontrolliert. Diese Erkenntnisse könnten signifikant zu unserem Verständnis der Entstehung von Tumorstammzellen und eventuell zu einer spezifisch auf Stammzellen ausgerichteten Tumortherapie beitragen.

Während der letzten Jahre haben neue Erkenntnisse in der Stammzellbiologie unsere Ansichten darüber, wie ein Tumor entsteht, grundlegend verändert. Bisher dachte man, dass jede Zelle in einem Tumor das gleiche Potential hat, das Wachstum von Tumoren aufrecht zu erhalten bzw neue Tumore zu initiieren. Neuere Experimente deuten aber darauf hin, dass nur ein kleiner Anteil der Zellen das Tumorwachstum aufrechterhalten kann. Diese Zellen besitzen Stammzelleigenschaften und werden daher Tumorstammzellen genannt. Die Tumorstammzellhypothese ist möglicherweise nicht auf alle Tumore anwendbar, sie hat aber dennoch grosse Bedeutung fuer die Tumorbehandlung, da nur Therapien, die die Tumorstammzellen zerstören, erfolgreich sein können. Das Ziel dieses Projektantrags ist es, unter Verwendung der Fruchtfliege Drosophila melanogaster die molekularen Mechanismen zu erforschen, die die Proliferation von Stammzellen kontrollieren, und die Defekte zu beschreiben, die normale Stammzellen in solche Zellen verwandeln, die Tumore bilden können. Vor kurzem hat unsere Forschungsgruppe das Protein Brat als einen wichtigen Regulator für die Vermehrung von neuralen Stammzellen in Drosophila identifiziert. Während der Teilung von Stammzellen segregiert Brat asymmetrisch in nur in eine der zwei enstehenden Tochterzellen, wo es nach derzeitigem Wissen das Zellwachstum und die Vermehrung hemmt. In Brat Mutanten proliferieren alle Tochterzellen und behalten Stammzelleigenschaften, was zu einer exponentiellen Expansion der Stammzellpopulation und letztendlich zu neoplastischer Zellwucherung und zur Bildung von Stammzelltumoren führt. Brat ist auch im Menschen konserviert und seine Homologen sind in menschlichen Tumoren dereguliert, was daraufhin deutet, dass sie eine ähnliche Funktion in höheren Organismen spielen. Es ist aber nicht bekannt, durch welchen Mechanismus Brat die Zellvermehrung von Stammzellen kontrolliert. In diesem Antrag wollen wir Bindungspartner von Brat mit Hilfe von Immunpräzipitation und quantitativer Massenspektrometrie identifizieren. Da Brat ausserhalb des Nervensystems als Repressor der Proteintranslation wirkt, wollen wir in einem weiteren Versuchsansatz durch den quantitativen Vergleich des Proteoms von Wildtyp und Brat mutanten Zellen Proteine identifizieren, die entweder direkt oder indirekt von Brat reguliert werden. Dazu werden wir die Proteine differentiell mit stabilen Isotopen markieren und massenspektrometrisch identifizieren und quantifizieren. Die Experimente werden in enger Zusammenarbeit zwischen einer Drosophila und einer Massenspektrometrie Forschungsgruppe durchgeführt. Diese enge Zusammenarbeit ermöglicht die Etablierung von technisch anspruchsvollen chromatographischen und massenspektrometrischen Methoden und ihre Anwendung auf die beschriebene spezifische biologische Fragestellung. Die identifizierten Proteine werden mit Hilfe etablierter genetischer und zellbiologischer Drosophila Methoden funktionell charakterisieren. Wir werden sowohl transgene Fliegen generieren, die diese Gene überexprimieren, als auch durch transgene RNAi die Expression der Proteine unterdrücken. Dafür steht uns eine Kollektion induzierbarer RNAi Linien zur Verfügung, die die funktionale Analyse einer grossen Anzahl von Genen in sowohl im Wildtyp- als auch im Brat mutanten Hintergrund erlaubt. Diese Experimente sollen neue Aufschlüsse über die molekularen Mechanismen geben, durch die Brat die Proliferation von Drosophila Neuroblasten kontrolliert. Diese Erkenntnisse könnten signifikant zu unserem Verständnis der Entstehung von Tumorstammzellen und eventuell zu einer spezifisch auf Stammzellen ausgerichteten Tumortherapie beitragen.