Neue Methoden zur Gewinnung und Analytik von Wurzelexsudaten

Pflanzenwurzeln können den umgebenden Boden (Rhizosphäre) durch die Abgabe von organischen Substanzen, die sog. Wurzelausscheidungen, stark beeinflussen und Änderungen in den chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften hervorrufen. Das hat einen wesentlichen Einfluss auf die Bioverfügbarkeit von Nähr- und Schadstoffen. Wurzelausscheidungen sind schon seit längerer Zeit Ziel von Forschungsarbeiten, jedoch wurde in den meisten Fällen nur ein kleiner Ausschnitt des Gesamtspektrums der ausgeschiedenen Substanzgruppen untersucht. Darüber hinaus wurden die meisten Versuche in Nährlösungskulturen durchgeführt, wo sich die Quantität und Qualität der Exsudate deutlich von in Boden gewachsenen Pflanzenunterscheiden können. Das Ziel dieses Projektes ist die Anwendung von hochentwickelten Methoden zur Analyse von verschiedensten Substanzklassen in Wurzelexsudat-Proben. Zur Probengewinnung werden Versuche in Rhizoboxen durchgeführt, wo die Pflanzenwurzel Kontakt zum Boden hat. Dafür ist es aber notwendig, spezielle Probengewinnungsmethoden anzuwenden, die einerseits geringe Volumina liefern und andererseits das Ergebnis nicht verfälschen. Die Ziel des 1. Arbeitspakets sind: 1. die Entwicklung von Extraktionsmethoden für Rhizosphärenboden; 2. die Verbesserung von Mikrosaugkerzen, die die Konzentration in der Probenlösung möglichst wenig verfälschen; 3. die Verbesserung eines neu entwickelten Exsudat-Sammelsystems durch das Testen von neuen Materialien, die möglichst wenig von den gewonnenen Exsudaten adsorbieren. Im 2. Arbeitspaket werden hochmoderne analytisch-chemische Methoden für die Bestimmung von Wurzelexsudaten entwickelt und angewandt. Ein miniaturisierten Flüssigkeitschromatographie-System, welches mit einem Massenspektrometer gekoppelt ist (LC-MS) wird speziell für die Analyse von kleinen Wurzelausscheidungsvolumina adaptiert. Ausserdem wird ein zweidimensionales LC-MS System zur simultanen Bestimmung verschiedener Substanzklassen etabliert. Weiters werden online-Probenanreicherungs-systeme entwickelt, um möglichst geringe Exudatkonzentrationen messen zu können. Im 3. Arbeitspaket werden die im Arbeitspaket 1 und 2 validierten Methoden anhand einer Fallstudie hinsichtlich ihrer Relevanz bewertet. Dieses Projekt wird einen wesentlichen Beitrag leisten, um die komplexen Prozesse in der Rhizosphäre, die durch die Wurzelausscheidungen ausgelöst werden, besser zu verstehen.

Die Gewinnung, Detektion und Quantifizierung von Wurzelausscheidungen (Exsudate) in der Rhizosphäre, also jenem Teil des Bodens der von der Wurzelaktivität beeinflusst ist, ist durch die schwierige Probenahme und die geringe Probemenge bzw. die teilweise sehr niedrige Konzentration eine große Herausforderung. Die Aufklärung von Rhizosphärenprozessen, die ganz wesentlich von den Wurzelausscheidungen beeinflusst werden, ist aber von herausragender Bedeutung im Hinblick auf das bessere Verständnis von Pflanzenernährung, landwirtschaftlicher Produktion und der Sanierung von kontaminierten Böden mit Pflanzen. Im Bezug auf die Probengewinnung ist mit der Weiterentwicklung eines sogenannten Exudat-Kollektor-Systems gelungen, Exsudate von Wurzeln in einer Rhizobox (einem speziellen Wachstumssystem) zu gewinnen. In dieser Rhizobox entwickelt sich ein Wurzelgeflecht auf einer Nylonmembran, wobei die Wurzeln von den Bodenpartikeln getrennt sind, der Austausch der Bodenlösung aber möglich ist. Auf dieses Wurzelgeflecht wurde ein Membransytem appliziert, das kontinuierlich mit Wasser bzw. einer CaCl2 -Lösung gespült wurde. Mit diesem Spülsystem wurden die Exsudate gewonnen, bevor sie für die chemische Analytik aufbereitet wurden. Um dieses System zu validieren, wurde es mit herkömmlich verwendeten Nährlösungskulturen verglichen. Zusätzlich wurden in die Rhizobox noch Mikro-Saugkerzen eingebaut, somit war es möglich, die Exsudation mit den Werten, die dann tatsächlich in der Bodenlösung zu finden sind, zu vergleichen. Damit kann geklärt werden, inwieweit die Exsudate an die Bodenmatrix adsorbieren oder von den Bodenmikroorganismen abgebaut werden. Parallel zu den Probengewinnungsmethoden wurde auch die chemische Analytik weiterentwickelt. Für die Analyse von organischen Säuren (z.B. Zitronensäure) wurde eine LC-MS-Methode entwickelt, bei der die Analyten zunächst derivatisiert (also in eine detektierbare Form umgewandelt) werden. Dadurch wurde es ermöglicht, in einem Konzentrationsbereich von wenigen Nano-Mol bis 10 Mikro-Mol zu messen. Durch die Probenahme kommt es oft zu einer starken Verdünnung, daher war das Erreichen von sehr niedrigen Nachweisgrenzen - bei dieser Methode um einen Faktor 100 zu bisher verwendeten Methoden - ein ganz entscheidender Schritt. Für die Analyse von Aminosäuren wurde ebenfalls eine LC-MS-Methode entwickelt (hydrophilic interaction liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry in multiple reaction monitoring (MRM) mode). Hier konnten Nachweisgrenzen sogar im sub-nanomolaren Bereich erzielt werden. Weiters war es möglich, vor der LC-MS- Analyse ein Anreicherungsverfahren (automated solid phase extraction system) zu implemetieren. Für die Detektion von Phytosiderophoren, die für die Gewinnung von Eisen wichtig sind, wurde erstmals ein Kapillarelektrophoresesystem entwickelt, wobei es mit diesem Ansatz möglich war, nicht nur die Phytosiderophore an sich, sondern auch die Komplexe mit Metallen wie z.B. Eisen zu trennen. Diese Methode wurde zusätzlich herangezogen, die Stabilität der Phytosiderophor-Metall-Komplexe zu bestimmen. Diese methodische Entwicklung war gleichzeitig auch die Vorraussetzung für die Durchführung eines kürzlich gestarteten FWF-Projektes zur Klärung der genauen Wirkungsmechanismen von Phytosiderophoren bei der Eisenmobilisierung.