Charakterisierung der Toxizität des antifungalen proteins PAF

Wir beschäftigen uns seit einigen Jahren mit der Aufklärung der Wirkungsweise des niedermolekularen, Cystein- reichen und kationischen antifungalen Proteins PAF von Penicillium chrysogenum. PAF zählt mit anderen Peptiden aus P. nalgiovense, Aspergillus niger und A. giganteus zu einer neuen Gruppe von antimikrobiellen Peptiden aus Ascomyceten. Der Modellorganismus A. nidulans, der opportunistisch humanpathogene Pilz A. fumigatus und zahlreiche pflanzenpathogene Pilze gehören zu den PAF-sensitivsten Mikroorganismen. Daher birgt PAF ein enormes Potential für die Entwicklung neuartiger antimykotischer Therapien, die sowohl in der Medizin als auch in der Landwirtschaft und in der Lebensmittelindustrie zur Prävention von Pilzinfektionen zur Anwendung kommen könnten. Neben diesem biotechnologischen Potential, erweist sich PAF auch besonders nützlich für die Erforschung der pilzlichen Zellbiologie. In diesem Sinne konnten wir in vorangegangenen Studien nachweisen, dass der Wachstumsinhibition von sensitiven Organismen ein streng regulierter Mechanismus zugrunde liegt. Die Hyperpolarisation der Plasmamembran an den Hyphenspitzen, die Aktivierung von Ionenkanälen, sowie eine erhöhte Belastung durch oxidative Radikale führen dabei zu einem programmierten Zelltod (Apoptose). Für eine Wechselwirkung von PAF mit den Zielorganismus A. nidulans scheint die Aktivierung der G-Protein abhängige Signalkaskade als auch die aktive Aufnahme des antifungalen Peptids in die Zelle eine entscheidende Rolle zu spielen. Darüberhinaus führen sublethale Konzentrationen von PAF zu einer schwerwiegenden Veränderung der Hyphenmorphologie, die in Form eines stark verästelten Phenotyps sichtbar wird. In weiteren Experimenten konnten wir eine PAF-spezifische Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration in A. nidulans feststellen, was eine Störung des intrazellulären Kalziumgradienten auslösen könnte mit schwerwiegenden Folgen für die Morphologie und das Überleben der Zielorgansimen. Ausserdem konnten wir eine Neutralisation der Toxizität des antifungalen Proteins in Anwesenheit von geringen Mengen an Kalzium nachweisen, was die zentrale Rolle von Kalzium für die Aktivität von PAF unterstreicht. Eine exakte Charakterisierung der Wechselwirkung von PAF mit sensitiven Pilzen ist eine wichtige Grundvoraussetzung, um die Wirkungsweise zu verstehen und neue Strategien für effiziente antifungale Therapien zu entwickeln. Basierend auf unseren bisherigen Ergebnissen planen wir die PAF-abhängige Veränderung der intrazellulären Kalziumkonzentration detailiert zu untersuchen. Weiters wollen wir durch Mutagenese nach PAF- resistenten A. nidulans Mutanten suchen, um weitere Zielstrukturen zu identifizieren und zu charakterisieren, die in der Toxizität von PAF ein wichtige Rolle spielen könnten. Die PAF-induzierte Veränderung in der Genexpression soll mit Hilfe einer Genom-weiten Genexpressionsanalyse (Microarray Analyse) im Detail untersucht werden. Schliesslich planen wir, die Tertiärstruktur von PAF und von mutierten Formen von PAF zu analysieren, um jene Strukturen zu identifizieren, die die antifungale Toxizität von PAF determinieren.

Der Antibiotika produzierende Schimmelpilz Penicillium chrysogenum sezerniert das kleine, kationische und Cystein-reiche Protein PAF in den Kulturüberstand. PAF inhibiert die Sporenkeimung und das Hyphenwachstum von zahlreichen pflanzen-, tier- und humanpathogenen Schimmelpilzen. Das Ziel dieses Projekts war es, die Struktur von PAF aufzuklären und Proteinmotive zu identifizieren, die die Interaktion von PAF mit den Zielorganismen bestimmen. Darüber hinaus haben wir Signaltransduktionswege charakterisiert, die durch PAF reguliert werden und haben uns im Besonderen die PAF-Wirkung auf die pilzliche Kalzium (Ca2+) Homöostase untersucht. Weiters haben wir mit dem Screenen einer Saccharomyces cerevisiae Mutantengenbank begonnen um Gene zu identifizieren, die für eine PAF-Resistenz von Hefepilzen verantwortlich sind. Schließlich wurde eine Microarray Analyse durchgeführt, um die Regulation der Transkription von Genen in Antwort auf PAF im humanpathogenen Aspergillus fumigatus zu untersuchen und mögliche pilzliche Zielmoleküle zu charakterisieren. Beide letztgenannten Ansätze sind derzeit noch in Bearbeitung.Die Strukturanalyse von PAF mittels Nuklearer Magnetresonanz (NMR) Spektroskopie zeigte, dass PAF ein kompakt gefaltetes Protein ist, das durch drei Schwefelwasserstoffbrückenbindungen im Proteininneren stabilisiert wird. Diese kompakte Struktur führt zu einer hohen Stabilität gegenüber extremen Umwelteinflüssen (hohe Temperaturen, weiter pH-Bereich, Proteaseverdau). Ein positiv geladenes Motiv an der Proteinoberfläche ist essentiell für die volle biologische Aktivität von PAF. Mithilfe von Pilzmutanten, die defekte Signaltransduktionswege aufweisen, und einem pharmokologischen Ansatz konnten wir zeigen, dass PAF die Proteinkinase A vermittelte Signaltransduktionkaskade aktiviert, die im direkten Zusammenhang mit Ca2+-vermittelter Signaltransduktion und programmiertem Zelltod in Verbindung steht. Wir haben intensiv die Auswirkungen von PAF auf die pilzliche intrazelluläre Ca2+ Homöostase untersucht und herausgefunden, dass PAF eine nachhaltige Erhöhung der intrazellulären Ca2+ Konzentration bewirkt, welche direkt mit der Wachstumsinhibition in Zusammenhang steht. Wir konnten zeigen, dass PAF verwandte antifungale Proteine in ähnlicher Weise auf Signaltransduktionskaskaden und die Ca2+ Homöostase einwirken. Wir konnten aber ebenso Unterschiede im Wirkungsmechanismus dieser Proteine nachweisen. Das antifungale Protein AFPNN5353 von Aspergillus (A.) giganteus aktiviert z.B. den Zellwand-Integritäts-Signalweg in sensitiven Pilzen und führt dadurch zur Verstärkung der Zellwände. PAF hingegen aktiviert diesen Signalweg nicht. Allerdings führt eineGrundaktivität dieses Signalwegs zu einer basalen Resistenz gegenüber sub-lethalen PAF Konzentrationen. Die Auswertung der Genexpressionsanalyse zeigte die Deregulation von Genen im PAF-behandelten humanpathogenen A. fumigatus, die eine Rolle spielen in Metabolismus, Prozessierung von genetischer Information, Antwort auf Umweltsignale, Funktion der Mitochondrien, Fettsäure- und Lipidmetabolismus und zellulären Prozesse (Zellzyklus, Wachstum und Zelltod). Der Effekt von PAF auf Mitochondrien wurde funktionell detaillierter untersucht und es zeigte sich, dass PAF die Atmung und die ATP Produktion im sensitiven Pilz stark beeinträchtigt. Schließlich konnten wir eine bisher noch nicht beschriebene Funktion von kleinen, sezernierten, Cystein-reichen pilzlichen Proteinen charakterisieren. PAF und Anisin1 aus A. nidulans spielen eine wichtige Rolle in der Regulation der asexuellen Differenzierung und in der Stress-Antwort im Produzenten selbst. Diese Proteine scheinen also wichtige Signalmoleküle zu sein, die zur Fitness der Pilze beitragen.Wir konnten also erfolgreich neue antifungale Zielmoleküle beschreiben. Unsere Ergebnisse ermöglichen uns, neue zukunftsweisende Hypothesen aufzustellen um auf diesem Gebiet weitere Forschung voranzutreiben.