Reifung Eukaryontischer Ribosomen

Ribosomen sind jene Organellen aller lebenden Zellen, die für die korrekte Übersetzung der mRNA in die Aminosäuresequenz von Proteinen verantwortlich sind. Die 80S Ribosomen der eukaryontischen Zellen bestehen aus einer 60S und einer 40S Untereinheit, die aus verschiedenen ribosomalen RNAs (rRNAs) und ribosomalen Proteinen aufgebaut sind. Die meisten der rRNAs werden in Form eines langen gemeinsamen Vorläufermoleküls gebildet, aus dem durch komplexe Prozessierungs- und Modifikations-Reaktionen die reifen rRNAs der großen und kleinen Untereinheiten entstehen. Die rRNA Prozessierungs- und Modifikations-Reaktionen werden durch snoRNAs und Proteinfaktoren koordiniert. Zusammen mit verschiedenen rRNA Vorläufern und ribosomalen Proteinen bilden diese Faktoren so genannte prä-ribosomale Partikel. Arbeiten aus verschiedenen Labors haben zur Isolierung von mehreren Vorläuferpartikeln für die große und kleine ribosomale Untereinheit geführt, die unterschiedliche prä-rRNA Zwischenprodukte und verschiedene nichtribosomale Proteine enthalten. Die meisten der nichtribosomalen Proteine werden im Zuge der Reifung der prä-ribosomalen Partikel bereits im Kern abgelöst. Einige jedoch begleiten die prä-ribosomalen Partikel bis ins Zytoplasma, um dort abgelöst und in den Kern zurückgeführt zu werden. Die Ablösung dieser "shuttling" Proteine und ihre Rückführung in den Kern sind essentiell für die Aufrechterhaltung der Ribosomenbiogenese. Unsere eigenen vorläufigen Resultate zeigen, dass die AAA-ATPase Drg1p eine wichtige Funktion in der Ablösung von solchen "shuttling" Proteinen ausübt. AAA-Proteine sind spezifische Chaperone, die die ATP-abhängige Auflösung von makromolekularen Komplexen katalysieren. Wir haben gefunden, dass Drg1p an eine Subpopulation von prä-60S Partikel unmittelbar nach deren Export aus dem Kern bindet. Diese Subpopulation stellt vermutlich das früheste zytoplasmatische Zwischenprodukt der Biogenese der großen Untereinheit dar, das bislang bekannt ist. In diesem Projekt, werden wir die Zusammensetzung dieses prä-ribosomale Partikels detailliert charakterisieren und mit, im Kern lokalisierten prä- ribosomalen Partikeln vergleichen, die bereits auf den Export vorbereitet sind. Dieser Vergleich wird es uns ermöglichen, die Veränderungen, denen das prä-ribosomale Partikel im Zuge des Kernexportes unterliegt detailliert zu beschreiben, und alle "shuttling" Proteine zu identifizieren. Mittels Mutanten, die kein funktionsfähiges Drg1p herstellen können werden wir denn Einfluss dieses Proteins auf die Ablösung von diesen "shuttling" Proteinen untersuchen. Unsere Untersuchungen werden es letztendlich erlauben, die Ablösung von "shuttling" Proteinen detailliert in vitro zu untersuchen, Diese Analysen werden einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Bildung der 60S ribosomalen Untereinheit liefern.

Ribosomen sind jene Organellen in der Zelle die für die Translation der mRNA in die Polypeptidketten von Proteinen verantwortlich sind. Sie bestehen aus einer großen und einer kleinen Untereinheit, die aus unterschiedlichen ribosomalen RNAs und ribosomalen Proteinen aufgebaut sind. Während generelle Aspekte der Translation bereits seit vielen Jahren gut untersucht sind, konnten Fortschritte in der Frage wie die Ribosomen in der Zelle gebildet werden erst in den letzten Jahren aufgrund verbesserter Affinitätsreinigungs- und Analysemethoden erzielt werden. Obwohl die meisten ribosomalen RNAs ursprünglich auf einem gemeinsamen prä-rRNA Transkript vorhanden sind, findetet ein Großteil der weiteren Reifungs- und Assemblierungsschritte der großen und kleinen ribosomalen Untereinheit sowie deren Export ins Cytoplasma auf separaten Wegen statt. Bis vor wenigen Jahren wurde angenommen, dass der Großteil der Ribosomenreifung im Kern stattfindet und nur mehr weniger bedeutende Reifungsschritte im Cytoplasma erfolgen. In den letzten Jahren wurde jedoch durch die Arbeit unserer und anderer Arbeitsgruppen deutlich, dass einige essentielle Assemblierungsreaktionen erst im Cytoplasma durchgeführt werden. Dieses Projekt hatte zum Ziel cytoplasmatische Assemblierungsreaktionen unmittelbar nach dem Export der großen ribosomalen Untereinheit ins Cytoplasma zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass die AAAATPase Drg1 essentiell für die Ablösung von sogenannten shuttling Proteinen (das sind nichtribosomalen Proteine, die die große Untereinheit ins Cytoplasma begleiten) ist. Inaktivierung des Drg1 Proteins in einer temperatur-sensitiven drg1-18 Mutante oder Depletion des Proteins bewirkt die Akkumulation aller bisher bekannten shuttling Proteine im Cytoplasma. Weitere Untersuchungen zeigten, dass alle nachfolgenden cytoplasmatischen Reifungsschritte in der drg1-18 Mutante blockiert sind. Diese Resultate zeigen, dass die cytoplasmatischen Reifungsschritte des prä-60S Partikels durch Drg1 initiiert werden. In weiterer Folge konnten wir nachweisen, dass Drg1 mit Komponenten des Kernporenkomplexes in vivo und in vitro interagiert und starke genetische Interaktion zwischen drg1-Allelen und Mutanten in Genen des Kernporenkomplexes vorliegt. Zusammengenommen deuten unsere Resultate an, dass Drg1 an den Kernporenkomplex rekrutiert wird und von dort auf das prä-60S Partikel unmittelbar nach dessen Export weitergereicht wird, um die Cytoplasmatische Reifung des Partikels zu initiieren.