Eukaryontische Carboxysomen in Cyanophora paradoxa

Photosynthese stellt die unverzichtbare Grundlage für alle höheren Lebensformen auf unserer Erde dar. Zu der enormen Menge von mehr als 200 Milliarden Tonnen CO 2 , die pro Jahr in Biomasse umgewandelt werden, tragen aquatische Mikrorganismen, wie Cyanobakterien und Algen etwa 50% bei. Ermöglicht wird dies durch CO 2 - Konzentrierungsmechanismen (CCM). Anhand des "lebenden Fossils" Cyanophora paradoxa, Glaucocystophyta, soll die Evolution des CCM untersucht werden. Dieser eukaryontische Phototrophe der ersten Stunde (phylogenetische Analysen weisen auf Gaucocystophyten als den ersten Zweig nach dem singulären endosymbiontischen Ereignis hin) hat eine einzigartige Brückenstellung zwischen Cyanobakterien und Algen inne. Nur bei den Glaucocystophyten findet man Plastiden (Cyanellen), die noch von einer Peptidoglykanwand umgeben sind, und - möglicherweise - das Schlüsselenzym Rubisco in der (quasikristallinen) Form eines Carboxysoms kompartimentiert. Beides ist sonst auf prokaryontische Organismen beschränkt. Bei Algen liegt Rubisco oft in Form eines funktionell ähnlichen Mikrokompartiments, des Pyrenoids, vor. Eine der beiden Theorien zur Entstehung des CCM setzt diese sehr früh an, vor mehr als 1,2 Milliarden Jahren und damit vor dem endosymbiontischen Ereignis, das die Chloroplasten von Algen und Pflanzen von in heterotrophe Zellen aufgenommenen Cyanobakterien ableitet. In diesem Fall hätten sich die Pyrenoide der Algen aus den Carboxysomen der Endosymbionten entwickelt und Cyanophora paradoxa könnte einen carboxysomalen CCM besitzen. Nach der zweiten Theorie sind die CCMs in Cyanobakterien und Algen unabhängig voneinander erst vor ca. 400 Millionen Jahren entstanden. Entscheidend ist die Lokalisierung der Carbonic Anhydrase (CA), die die Gleichgewichtseinstellung zwischen CO 2 und Bicarbonat katalysiert. In Carboxysomen ist sie mit Rubisco zusammen verpackt, bei Pyrenoiden befindet sie sich im Lumen der das Mikrokompartiment durchziehenden Thylakoidmembranen. In der Literatur wird der elektronendichte Zentralkörper der Cyanellen als Carboxysom geführt. Dafür spricht einiges, doch sind wichtige Befunde noch ausständig. Wir wollen mit verschiedenen Methoden bei der CA der Cyanellen ansetzen: Information über das Gen bzw. das Protein soll via EST- Sequenzierung, PCR mit degenerierten Primern, Massenspektrometrie der Proteinbanden nach Elektrophorese isolierter Zentralkörper, heterologe Western, heterologe Immun-EM, etc. erhalten werden. Liegt das Gen vor, soll der radioaktiv markierte Precursor in vitro in Cyanellen importiert werden und der Einbau in das "Carboxysom" bestimmt werden. Erst wenn alle Befunde vorliegen, kann über die Natur des Zentralkörpers entschieden werden. Auch eine Übergangsform von den Carboxysomen zu den Pyrenoiden hin kommt in Frage. Die im Vorprojekt etablierten Microarrays sollen unter geänderten Bedingungen (Starklicht, Stickstoffmangel) verstärkte Effekte von niedrigen CO 2 Konzentrationen auf die Genexpression zeigen. Die tatsächliche Akkumulation von Bicarbonat in Cyanellen soll bestimmt weden, um abschätzen zu können, ob die Peptidoglykanwand zwecks Osmoprotektion beibehalten werden musste. Auch andere von Cyanobakterien bzw. Algen her bekannte Komponenten des CCM wie Shell Proteine, putative und gesicherte Bicarbonat-Transporter, etc. sollen in den Cyanellen bzw. im Genom von Cyanophora nachgewiesen werden.

Die einzellige Alge Cyanophora paradoxa (Glaucocystophyta) stellt den Schlüssel zum Verständnis der Evolution der Chloroplasten aus endosymbiontischen Cyanobakterien dar. Die einzigartigen Eigenschaften der photosynthetischen Organellen (Cyanellen) dieses "lebenden Fossils" sind: 1) eine Peptidoglykanwand, wie sie sonst nur bei Bakterien vorkommt und 2) das Vorliegen von "Carboxysomen" - unsere Arbeitshypothese. Carboxysomen kommen ebenfalls sonst nur bei Cyanobakterien vor und spielen als quasi-kristalline Aggregate aus Ribulosebisphosphatcarboxylase (Rubisco) eine wichtige Rolle im CO 2 -Konzentrierungsmechanismus (CCM). Dieser beruht auf einer starken Anreicherung von Bicarbonat innerhalb der Zelle, welches dann in den Carboxysomen durch die dort mitverpackte Carbonic Anhydrase (CA) wieder in CO 2 verwandelt und gleich von der massiv vorhandenen Rubisco fixiert wird. So können photosynthetische Mikroorganismen trotz der in wässriger Lösung noch ungünstigeren CO 2 -Konzentration vernünftige Wachstumsraten erreichen und etwa 50% (d. h. gleich viel wie der Regenwald) zur globalen CO 2 -Balance beitragen. Auch Algen (Eukaryonten) haben einen CCM, der hier aber auf einem ähnlichen Rubisco-haltigen Mikrokompartiment basiert: dem Pyrenoid. Das Pyrenoid (meist eines pro Chloroplast) ist wesentlich größer als die Carboxysomen und hat weder deren polyedrische Strukur noch eine elektronendichte begrenzende Schicht aus sogenannten Hüllproteinen. Das Pyrenoid wird von Thylakoidmembranen durchzogen, in deren Lumen sich die CA befindet - zumindest bei Chlamydomonas reinhardtii. Von der Größe und vom Vorliegen in einer Alge her, sollte das Rubisco-Mikrocompartiment von C. paradoxa als Pyrenoid klassifiziert werden. Eine interessante Theorie vernüpft aber das putative "eukaryontische Carboxysom" mit der Peptidoglykanwand und gibt eine plausible Erklärung für deren Beibehaltung: bei der primären Endosymbiose wurde der carboxysomale CCM auf die Glaucocystophyten übertragen. Die Anreicherung von Bicarbonat um einen Faktor > 1000 ist in den Organellen nur möglich, wenn die osmotisch stabilisierende Peptidoglykanwand auch erhalten bleibt. Alle andere Algen haben im Verlauf der Evolution auf einen pyrenoidalen CCM umgestellt (Faktor nur 70) und konnten das in einem Eukaryonten für die Plastidenteilung eher hinderliche Peptidoglykan abgeben. Unsere Arbeiten zielten darauf ab i) einen CCM in C. paradoxa eindeutig zu beweisen, ii) Elektronenmikroskopie einzusetzen und iii) mit (genomischen und) proteomischen Methoden CA bzw. Hüllproteine in Präparationen der "Carboxysomen" nachzuweisen. i) wurde positiv erledigt, wodurch eine Publikation über CO 2 - responsive Gene möglich wurde, ii) lieferte interessante morphologische Unterschiede der Mikrokompartimente bei hohen und niederen CO 2 -Konzentrationen aber keine Bestätigung für eine Proteinhülle und iii) ergab eine Anzahl unbekannter Proteine, die vorläufig noch nicht als CA oder Hüllproteine identiziert werden konnten: die Frage Carboxysom oder Pyrenoid bleibt also weiterhin offen.