SSR Marker für die Gattung Cucurbita

In einem vorangegangenen FWF-Projekt (Nr. P15773) haben wir die erste genetische Karte für Cucurbita pepo erstellt. Dabei wurden hauptsächlich RAPD und AFLP Marker verwendet (Zraidi et al. 2006). Darüber hinaus haben wir auch die ersten 22 Cucurbita SSR-Marker entwickelt. Inspiriert durch die Ergebnisse dieses Projekts, sowie durch die Erfordernisse eines parallel laufenden Cucurbita-Züchtungsprogramms, verfolgt das hier vorliegende Forschungsvorhaben drei Hauptziele: 1. Aus partiellen genomischen Bibliotheken werden etwa. 200 polymorphe SSR Marker, ca. zur Hälfte aus C. pepo und C. moschata, für die Gattung Cucurbita isoliert. Ein erfolgreicher Abschluss dieses Projektziels ermöglicht zunächst die Auffindung von Markern, die mit agronomisch wichtigen, vor allem quantitativ vererbten Merkmalen (QTL) gekoppelt sind. Diese können für Marker gestützte Selektion (MAS) genutzt werden. Sie helfen aber auch die phylogenetischen Beziehungen in der Gattung Cucurbita besser zu verstehen. 2. Unter Verwendung von drei C. moschata Genotypen werden zwei genetische Karten erstellt. Danach werden jene Marker, die in C. moschata kartiert werden konnten und die zwischen den Eltern einer C. pepo Kartierungspopulation des vorangegangenen Projekts polymorph sind, auch in dieser C. pepo Population kartiert. Genetische Karten dienen zunächst zur Lokalisierung von Genen im Verhältnis zu Markern, vor allem von QTL, die wichtige Eigenschaften kontrollieren. Ein Vergleich der C. moschata und C. pepo Karte wird die Co-Linearität (Syntenie) der beiden Genome aufzeigen. SSR Marker könnten die vermutete polyploide Natur der Gattung aufdecken. 3. Mit Hilfe von zwei selektierten Gruppen von Cucurbita-Genotypen wird der Informationsgehalt der SSR-Marker bezüglich Polymorphismus (PIC) bestimmt. Marker mit hohen PIC-Werten sind vor allem wertvoll zur Abschätzung verwandtschaftlicher Beziehungen bei der Verwaltung von Kollektionen von Genotypen, zum Beispiel in einem Hybridzüchtungsprogramm. Weiterhin erlauben PIC-Wert-Informationen die Auswahl der geeigneten Marker für spezifische Aufgaben.

SSR-Marker, auch `Simple Sequence Repeats` genannt, sind kurze Abschnitte von genomischer DNA, bestehend aus aufeinanderfolgenden, wiederholten Sequenzmotiven, von einem bis zu sechs Nukleotiden. Sie sind von beiden Seiten durch einmal vorkommende Sequenzen begrenzt. Sie sind häufig und kommen relativ gleichmäßig, sowohl in repetitiven, wie auch in nicht-repetitiven Sequenzen vor. Mit zwei Primern, die zu den beiden Randsequenzen synthetisiert werden, ist die jederzeitige Amplifikation dieser SSR Sequenz möglich. Sie bietet eine physische Markierung im Genom. Durch einen relativ häufig vorkommenden Fehler bei der DNA Replikation (slippage) kann sich die Anzahl der Motivwiederholungen in diesem SSR-Lokus verändern, wodurch Allele dieses Lokus entstehen. Diese Eigenschaften machen SSR-Loci zu idealen molekularen Markern, die leicht handhabbar sind und, sowohl in der praktischen Pflanzenzüchtung, als auch in der angewandten oder Grundlagenforschung vielfältig eingesetzt werden können. Ihr einziger Nachteil ist, dass ihre Auffindung und Isolierung recht teuer ist. Dennoch gibt es mittlerweile, hunderte, für manche Kulturpflanzen wie Mais tausende, von SSR Markern. Sie wurden für Verwandtschaftsanalyen, Genotyp-Identifikation, für die Konstruktion von genetischen Karten und, auf deren Basis, für Genklonierung und, wenn sie gekoppelt mit agronomisch wichtigen Eigenschaften gefunden werden, für Marker-gestützte Selektion in der Pflanzenzüchtung verwendet. Bisher gab es für Cucurbita Arten keine SSR Marker, ein Zustand dessen Änderung das hier beschriebene Projekt zum Ziel hatte. Wir isolierten aus genomischer DNA von je einem Genotyp der beiden Arten C. pepo und C. moschata über 560 funktionelle SSR Marker. Mit diesen Markern erstellten wir für beide Species eine genetische Markerkarte, die uns die enge genetische Verwandtschaft der beiden Arten zeigte. Unter Verwendung von mehr als 100 verschiedenen kultivierten, wildwachsenden und Zier-Genotypen der Art C. pepo haben wir eine nur auf SSR-Markern basierende Verwandtschaftsanalyse durchgeführt. C. pepo ist weltweit die am häufigsten angebaute Cucurbita Art. Diese Studie hat uns wichtige neue Einblicke in die Evolution und jüngere Geschichte, auch bezüglich der weltweiten Verbreitung dieser Art erlaubt. Die hohe Übertragbarkeit der Marker in andere Arten innerhalb der Gattung Cucurbita, veranlasste uns zur Durchführung einer weiteren Verwandtschaftsanalyse, die acht, teils wilde, teils kultivierte Arten und deren in unterschiedlicher Anzahl bekannte Unterarten umfasste. Diese Untersuchung ist noch in der Phase der statistischen Auswertung. Schließlich haben wir uns auf das Gebiet der molekularen Genomanalyse gewagt, indem wir genomische DNA von C. pepo sequenzieren ließen. Wir erhielten die Sequenzen von 2,350,074 Fragmenten (reads) mit einer durchschnittlichen Länge von 330 Basenpaaren (bp). Diese Zahlen ergeben eine Gesamtlänge von 774,441,382 bp. Diese Länge entspricht einer ca. 1,5-maligen Abdeckung des Kürbisgenoms. Diese Sequenzen werden mit Mitteln der Bioinformatik analysiert, indem sie mit Sequenzinformationen von anderen Pflanzenarten, die in internationalen Datenbanken vorliegen, verglichen werden.