Das Öffnungsverhalten von L-Typ Kalziumkanälen

Das Forschungsprojekt wurde durch Befunde unserer Arbeitsgruppe aus jüngster Zeit initiiert, die zeigten, dass eine neuartige Sehstörung durch eine Punktmutation in einem vorrangig in der Retina exprimiertem L-Typ Ca2+ Kanal hervorgerufen wird. Dieser Austausch eines Isoleucins durch ein Threonin in Segment IIS6 (I745T) der porenbildenden a1-Untereinheit des Kanals vom Subtyp Cav1.4 verschiebt die Spannungsabhängigkeit der Aktivierungskurve des Kanals um -30 mV (Hemara-Wahanui, 2005). Unsere anschließenden Untersuchungen zeigten, dass das betroffene Isoleucin und benachbarte Aminosäuren auch in einem anderen L-Typ Kanal (Cav1.2) eine Schlüsselrolle bei der Kanalaktivierung spielen. Mutationen der Aminosäuren im entsprechenden Sequenzabschnitt 779-782 (LAIA) im unteren Drittel des Segments IIS6 führen zu: i) Verschiebungen der Spanungsabhängigkeit der Kanalaktivierung die von ii) einer Verlangsamung der Kanalaktivierung und iii) einer Verlangsamung der Deaktivierung begleitet sind (Hohaus, 2005). Diese vier Aminosäuren sind in anderen Ca2+ Kanälen vollständig konserviert, was auf Gemeinsamkeiten der Gatingmechanismen hinweist. Wir haben deshalb die Hypothese aufgestellt, dass - in Analogie zu Kaliumkanälen (Jiang, 2002) und einem bakteriellen Natriumkanal (NaChBac; Zhao, 2004) - Cav1.2 Kanäle unter Beteiligung einer Helix-Auslenkung in den Positionen 779-782 öffnen. Die molekularen Mechanismen der Aktivierungen von L-Typ Kanälen sowie die Ursachen von Kanalerkrankungen, die mit Veränderungen der Spannungsabhängigkeit der Aktivierung assoziiert sind (z. B. die oben genannte Sehstörung), bleiben jedoch unverstanden. Die Frage nach der Lokalisation des Aktivierungstores der Kanäle und der Rolle von I781T sowie benachbarter Aminosäuren für in Segment IIS6 soll u.a. durch systematische Struktur-Funktionsuntersuchungen an heterolog exprimierten Cav1.2 beantwortet werden. Zunächst werden die Determinanten der Porenstabilität in den S6 Segmenten identifiziert. Das unterschiedliche "Schaltverhalten" der Kanäle wird im Rahmen eines mathematischen Modells analysiert, welches sowohl steady- state Parameter als auch die zeitliche Kinetik des Öffnungsverhaltens berücksichtigt. Dadurch können Aussagen über die veränderte Stabilität des offenen und/oder geschlossenen Kanalzustandes getroffen werden. Es werden Interaktionen zwischen dem Spannungssensor und der Pore, besonders die Rolle der "S4-S5 Linker-Region", untersucht. Ein Homologie-Strukturmodell für einen L-Typ Kalziumkanal soll im Projektverlauf validiert werden. Es dient der Interpretation der Mutationsdaten. Im späteren Projektverlauf soll es die Rolle der Aktivierungstore für die Blockierung der L-Typ Kanäle durch Phenylalkylamine, Diltiazem und die 1,4 Dihydropyridine ("drug trapping", "receptor guarding" Mechanismen) klären. Die Untersuchungen sollen zum besseren Verständnis der Unterschiede im Aktivierungsverhalten verschiedener Ca2+ Kanalsubtypen und der Ursachen von Kanalerkrankungen (Hemara-Wahanui, 2005; Hohaus, 2005) beitragen.

Die Aufklärung der Struktur-Funktionsbeziehung von spannungsgesteuerten Kalziumkanälen ist eine der großen Herausforderungen der biophysikalischen und strukturbiologischen Forschung. Am Projektbeginn im Jahre 2007 stand die Entwicklung erster Homologiemodelle von Cav1.2, um Einblicke in das veränderte Gatingverhalten bei Ionenkanalerkrankungen, die durch Punktmutationen in der S6 Segmenten hervorgerufen werden, zu erlangen (Stary et al. 2008 a,b). In einer Übersichtsarbeit spekulierten wir, dass Spannungssensoren und porenbilde S6 Segmente von Cav1.2 weitgehend unabhängig funktionieren. Nach dieser Hypothese reagieren Spannungssensoren nach dem Alles oder Nichts-Gesetz auf Veränderungen des Membranpotentials wobei die Spannungsabhängigkeit der Cav1.2 selbst durch die Stabilität der Membranpore und Wechselwirkungen der S6 Segmente bestimmt wird (Hering et al. 2008). Um die Interaktionen zwischen Membranpore und Spannungssensor in Cav zu quantifizieren, schlugen wir ein 4-Zustandsmodell vor, welches die Aktivierung der Kanäle (R-A-O) und Deaktivierung (O-D-R) beschreibt. Spannungsabhängige Geschwindigkeitskonstanten beschreiben die Bewegung der Spannungssensoren und spannungsunabhängige Geschwindigkeitskonstanten die Stabilität der Membranpore, d.h. das Öffnungsverhalten des Kanalgates. In dieser Arbeit konnte erstmals eine S6 Mutation (A780T in IIS6) identifiziert werden, die direkt mit den Spannungssensoren interagiert. Um die Rolle der physiko-chemischen Eigenschaften der Aminosäuren im Aktivierungsverhalten der Kanäle zu untersuchen, wurde eine Mutations-Korrelationsanalyse entwickelt (Beyl et al. 2011). Mit dieser Technik gelang es das veränderte Aktivierungsverhalten bei S6-Punktmutationen vorherzusagen. Strukturanalysen mit verfeinerte Homologiemodelle zeigten später, dass A780 Bestandteil eines konservierten Rings kleiner Aminosäuren in den porenbildenden S6 Segmenten (Gly-432 (IS6), Ala-780 (IIS6), Gly-1193 (IIIS6), Ala-1503 (IVS6) ist, der in weiterer Folge als G/A/G/A Ring bezeichnet wird. Eine Hypothese wurde formuliert, nach der diese kleinen Reste mit bulky Aminosäuren in benachbarten Segmenten interagieren. Diese Interaktionen bilden sealing points, die zum festen Verschluss des Kanalgates im Ruhezustand beitragen (Depil et al. 2011). Unlängst erhoben wir den überraschenden Befund, dass Störungen des Aktivierungsverhaltens, die durch Mutationen auf S6 Segmenten hervorgerufen werden (besonders in der Region des G/A/G/A Rings), durch Neutralisierung der Ladungen eines Spannungssensors (IIS4) behoben werden können. Thermodynamische Analysen bestätigen eine Interaktion des G/A/G/A Rings mit den Spannungssensoren (S4 Segmenten). Dieser Befund eröffnete eine neue Sicht auf das Öffnungs- und Schließverhalten von Cav1.2. Segment IIS4 scheint nicht nur mit seinem S6 Segment der Domäne II zu kommuniziert, sondern interagiert über den G/A/G/A Ring auch mit den S6-Gates der anderen Domänen (IS6, IIIS6 und IVS6). Diesen Mechanismus bezeichnen wir als kooperatives Gating (Beyl et al. 2013a). In Beyl et al. 2013b entwickelten wir einen Algorithmus zur Quantifizierung der Interaktionen zwischen Kanalpore (dem Gate) und den Spannungssensoren. Dieses Verfahren ermöglicht erstmalig die Berechnung von Geschwindigkeitskonstanten des Öffnungs- und Schließverhaltens der Kanalpore sowie einer Gleichgewichtigkeitskonstante der Spannungssensoren aus makroskopischer Stromkinetik von Cav1.2. Weitere projektfinanzierte Arbeiten beschäftigten sich mit Struktur-Aktivitätsuntersuchungen an Cav3.1 Kanälen und (Karmazinova et al. 2011) und der Lokalisation der Bindungstasche von Diltiazem (Shabbir et al. 2011).