Replikon-Testsystem für virale Proteasen

Zwei wichtige Eigenschaften positiv-strängiger RNA Viren sind die hohe Fehlerrate ihrer Polymerasen und ihre Abhängigkeit von Proteinasen, die spezifisch längere Vorläufer in die reifen viralen Proteine spalten. Dieses Projekt wird die Fehleranfälligkeit der viralen RNA Replikation verwenden, um wesentliche Informationen über die Proteinasen zweier viraler Pathogene von globaler Bedeutung, nämlich des "human immunodeficiency virus (HIV)" und des "Hepatitis C virus (HCV)", zu gewinnen. Trotz des Erfolgs der anti-retroviralen Therapie gegen AIDS bleiben viele Fragen, betreffend die Mechansimen der Resistenzentwicklung der HIV Proteinase gegen Inhibitoren sowie die Spezifität der enzymatischen Spaltung selbst, offen. Ähnliche Fragen werden durch mögliche Therapien, die gegen die NS3/4 Proteinase von HCV gerichtet sind, aufgeworfen. Die Kontrolle vom HCV mittels Proteinase-Inhibitoren ist derzeit noch im Anfangsstadium klinischer Erprobung. Weitere Informationen über die Spaltspezifität und die Entwicklung therapieresistenter Mutanten wären äußerst wichtig für die weitere Entwickelung von Substanzen gegen HCV. Um diese Fragen zu beantworten, soll nun ein neues Testsystem für virale Proteinasen entwickelt werden, das auf der Verwendung von RNA Replikons des Flavivirus Frühsommer-Meningoenzephalitis Virus (FSME) beruht. Solche Replikons besitzen die für die RNA Replikation nötigen Gene und Signale, aber es fehlt ihnen die Information für zumindest ein essentielles Strukturprotein. Somit kann das Replikon zwar in der Zelle vermehrt werden, aber es können keine Viren oder "Virus-ähnliche Partikel (VLP)" produziert werden, es sei denn, die fehlenden Strukturproteine werden in trans zur Verfügung gestellt. In diesem Projekt werden die Replikons so entworfen, dass die Bildung von VLPs, die in Gewebekultur gut nachgewiesen werden können, von einer spezifischen Spaltung durch die HIV oder die HCV NS3/4 Proteinase abhängt, wobei diese Proteinasen vom Replikon selbst exprimiert werden. Entsprechende Spaltsequenzen werden zwischen das Kapsidprotein C und das Oberflächenprotein prM eingefügt, und das so modifizierte Vorläufer Polyprotein für die Strukturproteine stabil in BHK Zelllinien exprimiert. Nur wenn die FSME Strukturproteine von der HIV bzw. HCV Proteinase gespalten werden, werden VLPs generiert. Durch die der viralen RNA Polymerase eigene Fehlerrate werden ständig Mutationen in den Protease-Sequenzen eingeführt. Sollte die Spaltsequenz der Proteinase sub-optimal sein oder auch in Gegenwart eines Inhibitors, wird die VLP Bildung niedrig sein. Zufällig generierte Proteinase-Mutanten, die die sub-optimale Spaltstelle besser erkennen oder resistent gegen den Inhibitor sind, sollten einen Selektionsvorteil besitzen und mehr VLPs produzieren. Durch die Analyse der VLPs können diese Mutationen identifiziert und dadurch Informationen über die spezifische Wechselwirkung zwischen Proteinase und Substrat auf der Ebene einzelner Aminosäuren gewonnen werden. So stellt das Replikonsystem ein empfindliches Instrument zur Bestimmung der Substratspezifität und der Resistenzentwicklung gegen Inhibitoren dar.

Zwei wichtige Eigenschaften positiv-strängiger RNA Viren sind die hohe Fehlerrate ihrer Polymerasen und ihre Abhängigkeit von Proteinasen, die längere Vorläufer spezifisch zu reifen viralen Proteinen spalten. Dieses Projekt benutzte die Fehleranfälligkeit der viralen RNA Replikation, um ein neues Testsystem für virale Proteinasen zu entwickeln. Wir verwendeten RNA Replikons des Frühsommer-Meningoenzephalitis Virus (FSME). Solche Replikons besitzen die für die RNA Replikation nötigen Gene und Signale, aber es fehlt ihnen die Information für zumindest ein essentielles Strukturprotein. Somit kann das Replikon zwar in der Zelle vermehrt werden, aber es können keine Viren oder "Virus-ähnliche Partikel (VLP)" produziert werden, es sei denn, die fehlenden Strukturproteine werden in trans zur Verfügung gestellt. In diesem Projekt wurden die Replikons so entworfen, dass die Bildung von VLPs, die in der Gewebekultur gut nachgewiesen werden können, von einer spezifischen Spaltung durch die FMDV 3C Proteinase abhängig war. Um dieses System zu etablieren, untersuchten wir zuerst die Flexibilität einer FSME Sequenz zwischen dem Protein C und dem Protein prM. Wir fanden heraus, dass das Virus unerwarteterweise zahlreiche Substitutionen an dieser Stelle tolerieren kann und dass selbst Viren ohne signifikante Sequenzabschnitte durch die Selektion von "natural" Varianten lebensfähig werden konnten. Wir stellten auch fest, dass eine Spaltung zwischen C und prM durch die Einführung einer 18-Aminosäurensequenz des 2A Proteins des Maul-und-Klauen Seuche Virus ermöglicht wurde. Diese Sequenz unterbricht eine wachsende Polypeptidkette. Viren, die diese Sequenz besaßen, waren lebensfähig und in der Lage, weitere Zellen zu infizieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, die Spaltung an der C-prM Schnittstelle von der herkömmlichen NS2B/3 Proteinase Spaltung zu entkoppeln. Wir haben auch die Eigenschaften dieser Viren, die die 2A Sequenz vom FMDV besitzen, untersucht. Die FSME Mutante konnte nur eingeschränkt Säugetierzellen befallen und war unfähig, sich in Zeckenzelle zu vermehren. Im Gegensatz dazu konnte die WNV Mutante Gelsenzellen des natürlichen Wirts infizieren, war aber in Säugetierzellen instabil. Selbst das Entfernen von 3 spezifischen Aminosäuren der 2A Proteinsequenz sowohl in der FSME als auch in der WNV Mutante, erlaubte die Replikation der viralen RNA. Lebensfähige Viren wurden aber nicht hergestellt. Um das Problem zu überwinden, exprimierten wir die FMDV 3C Proteinase am Ende des viralen FSME Genoms. Wir konnten, nachdem der N-terminus der FMDV 2A für die Spaltung der FMDV 3C Proteinase optimiert worden war, virale Partikeln nachweisen. Bei einer Mutante mit inaktiver Proteinase konnten keine Partikel nachgewiesen werden. Daher ist bewiesen, dass die virale Replikation von der Aktivität der heterologen Proteinase abhängig ist. Wir werden mit dem System die Eigenschaften von anderen Proteinasen überprüfen. Wir versuchten, die Röntgenstruktur der NS2B/3 Proteinase festzustellen. Obwohl wir Milligrammmengen von reiner NS2B/3 Proteinase isolieren konnten, waren wir nicht in der Lage, reproduzierbare Kristalle zu bekommen.