Funktionsanalyse von Pumilio Proteinen in vitro und in vivo

In Neuronen sind bestimmte mRNAs in Dendriten lokalisiert. Die lokal erfolgende Translation durch spezifische Signale, wie synaptische Aktivität oder Neurotrophine, erlaubt es, einzelne Synapsen in ihrer Struktur und Funktion zu verändern. Diese Vorgänge stellen daher die Grundlage für solch fundamentale biologische Prozesse wie Lernen und Gedächtnis dar. Eine Schlüsseleigenschaft der Lokalisierung einzelner mRNAs ist, dass diese an ihre Zielorte transportiert werden, bevor sie in Einweiße übersetzt werden. Die lokalisierten mRNAs müssen folglich während des Transports translational reprimiert werden. Es ist derzeit unklar, ob ein überlappender Satz an Proteinen beide Aufgaben - RNA Transport und translationale Kontrolle - übernimmt. Ein potentieller Kandidat für eine duale Rolle ist das Protein Pumilio (Pum). In der Drosophila Oozyte wirkt Pum als Inhibitor der Translation. In Säugern sind zwei Pum Gene bekannt, Pum1 und Pum2. Die Funktion der entsprechenden Proteine, vor allem ihre Funktion in Neuronen, ist jedoch ungeklärt. In diesem Antrag soll primär untersucht werden, ob die Pumilio Proteine eine duale Funktion beim dendritischen RNA Transport und bei der Translationskontrolle in Neuronen ausüben. Zunächst sollen über einen biochemischen Ansatz sowohl die RNA, als auch die Protein-Komponenten der Pum Partikel im Rattenhirn identifiziert und anschließend charakterisiert werden. In einem zweiten Schritt wollen wir untersuchen, ob eine Missexpression von Pum Proteinen den dendritischen RNA Transport in hipocampalen Neuronen beeinflußt. Da Pum Proteine an der translationalen Repression verschiedener mRNAs in unterschiedlichen Organismen beteiligt sind, möchten wir desweiteren in Reporterassays untersuchen, ob Pum Proteine auch die Translation dendritisch lokalisierter mRNAs kontrollieren. In einem letzten Teilprojekt wollen wir, in Zusammenarbeit mit Dusan Bartsch (Mannheim, Deutschland), transgene Ratten generieren, in denen die Pum Proteine konditional und gewebsspezifisch ausgeschalten werden können, um erste Rückschlüsse auf die Funktion dieser wichtigen Proteinfamilie zu erhalten. Die Ergebnisse dieser Studien werden zu einem besseren Verständnis der molekularen Interaktionen zwischen dendritischem RNA Transport und translationaler Kontrolle in Neuronen führen.

Lernen und die Speicherung von Gedächtnis findet an den Kontaktstellen zwischen Nervenzellen, den Synapsen, statt. Allerdings sind die zellulären und molekularen Mechanismen, die zum Erlernen führen, noch weitgehend unbekannt. Es deuten mittlerweile immer mehr Hinweise darauf hin, dass an einer solchen "zu verschaltenden" Synapse als Antwort auf einen Reiz bestimmte Einweiße neu hergestellt werden. Die an der Synapse erfolgenden molekularen Veränderungen sind dabei essentiell für die Ausbildung von Lernen und Gedächtnis. Neuere Daten sprechen in diesem Zusammenhang für eine lokale Neusynthese einzelner Eiweiße an der Synapse. Dazu müssen Boten-RNAs (mRNAs) zunächst vom Zellkörper in die Dendriten - der empfangenden Seite der Synapsen - transportiert werden. Bei diesem "Gütertransport in Neuronen" spielt das RNA-bindende Protein Pumilio2 eine wichtige Rolle. Ein potentieller Kandidat für eine duale Rolle sowohl beim RNA Transport wie auch bei der Translationskontrolle sind die Pumilio (Pum) Proteine. In der Drosophila Oozyte wirkt Pum als Inhibitor der Translation, zudem ist es essentiell für eine spezielle Form des Lernens in der Fliege, bei dem es darum geht, einen unangenehmen Geruch zu vermeiden. In Säugern sind zwei Pum Gene bekannt, Pum1 und Pum2. In diesem Projekt, das von Paolo Macchi und seinem Team durchgeführt wurde, gelang es zunächst, Pum2 als Komponente neuronaler RNA Granula sowohl im Zellkörper wie auch in den Dendriten nachzuweisen. Im Anschluß daran gelang uns der Nachweis, dass Pum2 tatsächlich als Translationsrepressor an der Synapse fungiert. Dies ist nicht nur wichtig für die Translationskontrolle bestimmter Transkripte wie eIF4E, sondern auch für die Morphogenese und Funktion der Synapse selbst.